YAP、E-cadherin和Vimentin在口腔鱗癌中的表達及臨床意義

程如玉，韓 瑞，王尚華，丁 翔，丁丹丹，馮振中，徐錦程

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌，是頜面部最常見的惡性腫瘤之一，其侵襲和轉移是導致患者5年生存率較低的主要原因[1-2]。大量研究[3-4]表明上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不僅參與正常胚胎的發育和生成，而且與腫瘤的侵襲和轉移關系密切。Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)作為Hippo信號通路中起中心作用的開關蛋白，在細胞的正常發育過程中結合轉錄因子TEAD促進下游基因的表達，進而促進細胞增殖生長。雖然YAP在多數腫瘤中扮演著促癌基因的角色，但在某些情況下，其促調亡作用致使YAP作為促癌基因遭到質疑。YAP是否通過促進EMT進程，在OSCC侵襲和轉移中發揮重要作用，目前尚無相關報道。該研究旨在通過檢測YAP和EMT相關蛋白E-cadherin和Vimentin在OSCC中的表達情況，進而探究其與臨床病理參數的關系，以期為OSCC相關機制研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本選擇 收集蚌埠醫學院第一附屬醫院口腔頜面外科2013年1月～2016年12月手術切除的經病理科完好存檔的OSCC石蠟組織標本54例。要求原發部位在口腔，術前未行放療、化療及其他影響腫瘤的治療，術后病理證實為OSCC。同時選擇癌旁正常上皮組織標本(經擴大切除，距離癌組織邊緣3 cm以上)54例作為對照組。

1.1.2病例資料 男34例，女20例；年齡28～77歲，中位年齡52歲；高分化18例，中分化18例，低分化18例；有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移30例；舌癌24例，唇癌14例，牙齦癌10例，口底癌6例；根據WHO臨床分期標準分為Ⅰ期24例，Ⅱ期9例，Ⅲ期7例，Ⅳ期14例。本研究涉及的組織標本經醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.1.3主要試劑 兔抗人YAP多克隆抗體(ABP52720)購自武漢艾美捷科技有限公司;兔抗人 E-cadherin和Vimentin單克隆抗體(MAB-0589、MAB-0735)、即用型免疫組化 EliVisionTMplus試劑盒(KIT-9901)、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2實驗方法所有組織標本經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4～5 μm連續切片后，具體染色步驟嚴格按照 EliVisionTMplus/HRP免疫組化說明書進行。一抗YAP、E-cadherin及Vimentin稀釋比例均為1 ∶300。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3結果判定每張組織切片由2名病理科高年資醫師在雙盲下閱片。顯微鏡高倍視野下(×400)隨機選擇具有代表性的5個視野，根據周榕 等[5]、陳穎 等[6]判斷標準進行評分：① 染色程度:無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分；② 陽性染色細胞百分比:< 5 %，0分；6%～25 %，1分；26 %～50%，2分；>50 %，3分。總評分按①×②計算，總分<3分記為陰性反應(-)，≥ 3分為陽性反應(+)。

1.4統計學處理應用SPSS 24.0軟件進行統計分析。分析YAP、E-cadherin及Vimentin的表達與臨床病理參數之間的關系采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC和癌旁組織中的表達YAP陽性染色主要定位于細胞核和(或)細胞質，E-cadherin陽性染色主要定位于細胞膜，Vimentin陽性染色定位于細胞質。三者在OSCC和癌旁組織中的陽性表達率組間差異有統計學意義(P<0.01),見圖1、表1。

2.2YAP、E-cadherin和Vimentin的表達與OSCC臨床參數的關系YAP的表達與OSCC的分化程度及有無淋巴結轉移相關,差異有統計學意義(P<0.05)，而與臨床分期、性別、年齡、發病部位均無關(P>0.05)。E-cadherin和Vimentin的表達與OSCC臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移相關,差異有統計學意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、發病部位均無關(P>0.05),見表2。

2.3YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC中表達的相關性相關性分析顯示，YAP的表達與 E-cadherin的表達呈負相關性(r=-0.424,P=0.002)，與Vimentin表達呈正相關性(r=0.519,P=0.001)，見表3。

圖1 OSCC和癌旁組織中YAP、E-cadherin和Vimentin的表達 SP×400

A、B：YAP在OSCC及癌旁組織中的表達；C、D：E-cadherin在OSCC及癌旁組織中的表達；E、F：Vimentin在OSCC及癌旁組織中的表達

表1 YAP、E-cadherin及Vimentin在OSCC和癌旁組織中的表達[n(%)]

表2 YAP、E-cadherin和Vimentin的表達與OSCC臨床病理參數的關系 [n(%)]

表3 OSCC組織中YAP、E-cadherin和Vimentin的相關性分析(n)

3 討論

EMT是指上皮樣細胞表型在某些誘導因素的作用下向間質樣細胞表型轉化的過程。研究[7-8]表明EMT是癌細胞獲得侵襲和遷移能力的首要環節。細胞經歷EMT后表現出多種上皮標志物的表達下調和間質標志物的表達上調，其中以E-cadherin和Vimentin最為典型。E-cadherin僅在上皮細胞中表達，具有維持細胞極性、構建與相鄰細胞及外基質間黏附連接的作用，其表達減少是癌癥進展、侵襲和轉移的前提條件。Vimentin穩定表達于間葉細胞，作用與E-cadherin相反，其出現預示著癌細胞發生了間葉表型轉變。本研究結果顯示，E-cadherin在OSCC中的表達較癌旁組織明顯降低，在高分化、無淋巴結轉移組高表達，在中低分化、有淋巴結轉移組低表達；而Vimentin在OSCC中的表達較癌旁組織明顯增高，在高分化、無淋巴結轉移組低表達，在中低分化、有淋巴結轉移組高表達。表明隨著OSCC惡性程度的提高，癌細胞獲得EMT表型,發生了EMT現象。

Hippo信號通路是高度保守的信號轉導通路，YAP作為其下游的關鍵效應蛋白，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡和促進細胞惡性轉化的作用[9]。本研究結果顯示：YAP在OSCC中的表達顯著高于癌旁組織，YAP的陽性率與淋巴結轉移、病理分級亦有相關性，與Yoshikawa et al[10]的研究結果基本相符。但與之相悖的是，YAP的陽性率與臨床分期無關，這可能與樣本量較少有關，有擴大樣本量乃至更深一步研究的必要。除此之外，本研究結果還表明：高分化OSCC中YAP多單獨表達于細胞質，而中低分化OSCC中YAP可在細胞核及細胞質中均表達。這一現象表明：不同分化的OSCC細胞內已發生分子生物學變化，而YAP可能在其中起到了重要的作用。故細胞核YAP的高表達或許可作為評判OSCC進展及預后不良的指標之一。

有文獻[11-12]報道，YAP對EMT起到潛在的誘導作用。本研究結果顯示，YAP的高表達伴隨著E-cadherin表達的下調和Vimentin表達的上調，即YAP在OSCC中與E-cadherin的表達呈負相關性，與Vimentin的表達呈正相關性。這在一定程度上也表明了YAP可能作為誘導基因之一促進了EMT進程。其可能機制是YAP作為轉錄共激活因子，通過與Smad蛋白家族結合，進而激活轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的活性，TGF-β合成和釋放增加，導致細胞脫黏附、運動遷徙能力增強，從而促進OSCC的侵襲和轉移。