Wnt/β-catenin信號通路對毛囊干細胞增殖和分化的調控作用

夏肖雪 綜述 呂正梅，張守兵 審校

毛囊干細胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是一群位于毛囊隆突部的成體干細胞，具有一般干細胞的基本特性，即自我更新能力和多潛能性[1]。與胚胎干細胞的持續增殖和分化不同，它在大部分時間里處于靜息狀態，只在毛囊生長期早期被激活。它不僅維持正常皮膚中毛囊的再生，在皮膚損傷時移植毛囊干細胞還能重建毛囊、表皮和皮脂腺[2]。毛囊干細胞的增殖和分化受到嚴格調控，Wnt/β-catenin信號通路是其中重要的調控通路之一。

1 毛囊干細胞在毛囊發生和毛囊周期中的作用

目前普遍認為，在胚胎期毛囊的發育過程中，表皮成分與真皮成分間一系列復雜的相互作用誘導毛囊的形態學發生：首先，真皮細胞發出信號，誘導表皮基底細胞增厚形成毛基板；之后，毛基板細胞釋放趨化因子，誘導間充質成纖維細胞增生、聚集形成真皮聚集體，毛基板細胞增殖，形成毛芽，真皮聚集體最終發育成真皮乳頭；真皮乳頭細胞釋放信號，刺激毛囊干細胞增生，形成毛釘，并分化成毛囊中的各種細胞，形成完整毛囊及毛干[3](圖1)。

圖1 毛囊發生示意圖

毛發的生長不是連續的，而是呈現周期性，稱為毛囊周期，包括生長期、退行期、靜止期。在生長期末期，有絲分裂活動減緩并最終停止，繼而凋亡活動加劇，毛囊進入退行期，最終剩余的細胞在隆突部下方形成毛芽，真皮乳頭位于毛芽下方；在靜止期，毛囊干細胞處于靜息狀態；之后，毛芽和隆突部中的干細胞在真皮乳頭傳遞的信號刺激下被激活、增殖，毛囊進入下一個生長期，新形成的毛母質細胞包裹真皮乳頭，不斷增殖和分化，形成新的完整毛囊并產生毛干[4](圖2)。

圖2 毛囊周期示意圖

Wnt/β-catenin信號通路廣泛存在于多細胞真核生物中，高度保守。它在誘導毛囊形態發生、維持毛囊生長發育、干細胞聚集、遷移以及分化過程中發揮重要作用。在毛囊的周期性生長中，真皮乳頭被認為是調節毛囊形態發生和毛發生長的信號轉導中心，可通過Wnt/β-catenin信號通路誘導毛囊干細胞的增殖和分化。若Wnt失調，不僅會出現增殖和分化的失衡，還會導致腫瘤的發生[5]。

2 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，可通過旁分泌或自分泌發揮作用，與細胞膜上的七次跨膜卷曲蛋白(Frizzled)受體家族及低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL receptor related protein，LRP)結合，穩定并積累胞質內的β-catenin[6]。哺乳動物的基因組編碼十七種Wnt蛋白，在皮膚中表達的有Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和 Wnt16[7]。

β-catenin蛋白是Wnt信號通路的重要分子之一，參與胚胎形成及個體發育等多個生物學過程。在沒有Wnt時，細胞中的β-catenin與α-catenin及鈣黏素E(E-cadherin)形成復合物，參與細胞間以及細胞與細胞外基質的黏合連接；而胞質中游離的β-catenin被核心蛋白軸蛋白(axis inhibition，Axin)、腺瘤樣結腸息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、酪蛋白激酶-1α(casein kinase 1 alpha，CK1α)和糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β)組成的復合體磷酸化，E3泛素連接酶β-TrCP(β transducinrepeats-containing proteins，β-TrCP)識別磷酸化的β-catenin，通過蛋白酶體途徑將其降解，轉錄因子LEF/TCF(lymphoid enhancer factor/T-cell factor)與轉錄抑制因子TLE(transducin-like enhancer)結合，使染色體處于非活化狀態(圖3A)。而當Wnt結合到Frizzled和LRP5/6時，激活胞質蛋白Dvl(Dishevelled)，導致LRP5/6被CK1α和GSK3β磷酸化，Axin與LRP5/6結合，胞質中游離的β-catenin不被磷酸化而積累下來。β-catenin入核，取代TLE而與轉錄因子LEF/TCF結合，招募兩種組蛋白修飾因子CREB結合蛋白(CREB-binding protein，CBP)和Brg1以及輔激活因子如Bcl9和Pygo(Pygopus)，激活靶基因的表達(圖3B)[6, 8]。

3 Wnt/β-catenin信號通路在毛囊發生和毛囊干細胞增殖中的作用

3.1Wnt/β-catenin信號通路的激活誘導毛囊的發生在胚胎期毛囊發育過程中，Wnt/β-catenin信號通路的激活是毛基板形成的一個關鍵起始步驟[9]。分別在小鼠表皮角質細胞或真皮成纖維細胞中特異性地將Wnt分泌相關基因Evi/Wls(Wntless)敲除后發現，表皮來源的Wnt配體對真皮上部Wnt信號通路的激活是至關重要的，而后者的激活最終導致毛基板的形成[9-10]。這些研究表明，Wnt介導的信號首先出現在表皮內，其后才發生表皮和真皮間的復雜相互作用及形成毛囊。此外，過表達Wnt細胞外抑制劑DKK1 (Dkk-1)的轉基因小鼠能阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而影響毛囊的發生和發育，甚至最終導致出生后小鼠毛囊的缺失[11]。在胚胎發生期，條件性敲除表皮中的β-catenin基因導致毛基板的形成受阻，從而阻斷了毛囊的形態發生[12]。此外，毛基板形成后，在從毛芽到毛釘發育過程中，毛釘上部區域中的Wnt/β-catenin信號減弱，是毛囊干細胞形成的前提條件，因為Wnt/β-catenin信號抑制SOX9，而后者是毛囊干細胞形成所必需的[13]。

圖3 Wnt/β-catenin信號通路

3.2Wnt信號調控毛囊干細胞的增殖毛囊形成后，在哺乳動物的一生中處于生長期、退行期和靜止期的周期性循環中(圖2)。毛囊周期中，毛囊干細胞的靜息和激活受到微環境細胞來源的骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號和Wnt信號的嚴格調控。在靜止期，真皮成纖維細胞表達BMP4，皮下脂肪細胞表達BMP2，隆突部內層角蛋白K6+細胞分泌高水平的BMP6和FGF18。上述BMP蛋白和FGF18均抑制毛囊干細胞的增殖而將其維持在靜息狀態。靜止期末期，BMP表達降低，使毛囊干細胞較易于激活[5]。真皮乳頭通過分泌BMP抑制因子Noggin將毛囊干細胞中的BMP信號關閉，轉換為Wnt/β-catenin信號，從而激活毛囊干細胞增殖，毛囊進入生長期。實際上，從靜止期早期到晚期，真皮乳頭中毛芽激活因子如FGF-7、FGF-10和 TGF-β2 以及BMP抑制因子Noggin的水平是逐漸升高的[14]。如果去除真皮乳頭，靜止期毛囊不能進入生長期，說明真皮乳頭對于毛囊干細胞的激活來說是必需的[14]。在表達的Wnt蛋白中，Wnt7b可能在激活Wnt/β-catenin通路中起重要作用，該蛋白在出生后第一個生長期啟動時(出生后第21天)表達，但在靜止期不表達，若出生后敲除Wnt7b，毛囊干細胞的激活被遲滯[15]。然而，雖然關于毛囊從靜止期進入生長期調控機制的研究很多，但最早的激活機制是什么，或者說，上述信號通路又是被如何調控的，目前還不得而知。

Wnt、β-catenin和下游的LEF/TCF都在毛囊的再生中發揮重要作用。2013年，Choi et al[16]通過分別在整個表皮中、毛囊干細胞中和在毛囊間表皮中敲除β-catenin并與異位表達DKK1的結果相比較發現，Wnt/β-catenin信號通路對毛囊干細胞的增殖來說是必需的，但毛囊干細胞的維持不需要β-catenin存在于毛囊干細胞中。Lei et al[17]的結果證明，小鼠觸須Wnt10b蛋白的過表達可激活經典Wnt信號通路，促進毛母質細胞的增殖，從而誘導毛囊進入生長期；腺病毒介導的Wnt10b蛋白過表達誘導毛囊由靜止期進入生長期。相反，siRNA介導的Wnt10b基因敲除可阻止毛囊進入生長期[18]。Wnt10b介導的Wnt通路異常激活會使處于增殖狀態CD34+毛囊干細胞的數量增加，導致毛球、毛干和真皮乳頭都變大[19]。這些結果都表明，Wnt10b可通過激活Wnt信號通路促進毛囊干細胞增殖。

在成年小鼠的表皮中短暫表達β-catenin，正常的毛囊周期被打斷而進入生長期，并從頭形成新的毛囊[20]，表明依賴β-catenin的Wnt通路足以誘發毛囊干細胞的增殖及后繼新毛囊的生長。而在成體毛囊的真皮乳頭中敲除β-catenin基因，毛囊不能進入生長期[21]，說明真皮乳頭中的β-catenin對毛囊干細胞的增殖也具有調控作用。在體外培養條件下，β-catenin敲除的毛囊干細胞能夠自我更新和長期傳代；但是在體內，毛囊干細胞高表達TCF3/4，在沒有β-catenin激活的情況下，長時間處于靜息狀態而不增殖。進一步研究表明，對毛囊干細胞增殖的激活來說，β-catenin并不是必需的，如果TCF3/4的水平有效降低，不需要β-catenin即可激活增殖[22]。也就是說，TCF3/4的水平下降或是Wnt/β-catenin的水平上升，都會打破毛囊干細胞的靜息狀態，使毛囊進入生長期。

Garza et al[23]發現，雄激素性禿頂男性的頭皮中，K15+α6-整合素+的毛囊干細胞仍然存在，但前體細胞包括CD200+α6-整合素+和CD34+細胞均顯著減少，可能是導致毛囊體積變小、毛干短小的原因。這說明在禿頂頭皮中，毛囊干細胞的激活存在障礙，但是否是由于Wnt信號通路失調導致的，目前尚未發現相關研究。

關于靜止期隆突部毛囊干細胞中的Wnt/β-catenin信號通路，很多結果傾向于認為其處于被抑制的狀態，例如Wnt抑制因子SFRP1、Dkk3和WIF1在毛囊干細胞和真皮乳頭中高表達，而Wnt蛋白Wnt3和Wnt3a表達下調3倍以上[5]。Dasgupta et al[24]和Lien et al[22]分別發現，Wnt/β-catenin信號通路的報告基因TOPGAL和Axin2-LacZ在靜止期毛囊干細胞中處于失活狀態，這與靜止期隆突部毛囊干細胞核中無β-catenin是一致的。然而，2016年，Lim et al[25]發現，在整個靜止期，Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子之一Axin2在處于靜息狀態的隆突部外根鞘毛囊干細胞中持續表達，當β-catenin被條件性敲除時，Axin2的表達缺失。因此，靜止期毛囊干細胞中Axin2的表達依賴于β-catenin的存在，許多其他Wnt靶基因如Lgr5也是如此，這表明Wnt/β-catenin信號在靜止期毛囊干細胞中可能是處于活化狀態的。深入研究發現，在整個靜止期中，Wnt1、Wnt4和Wnt7b在隆突部都表達，在外根鞘細胞中表達最高，Wnt5a不表達，而Wnt3、Wnt6、Wnt10a和Wnt10b雖然表達，但處于較低水平，這表明靜止期隆突部毛囊干細胞本身即為Wnt信號的來源[25]。在從靜止期向生長期過渡時，Axin2、Wnt1、Wnt4和Wnt7b在隆突部持續表達，而Wnt6、Wnt7b、Wnt10a和Wnt10b在毛芽和真皮乳頭交界處的細胞中表達上調，后者表明某些Wnt蛋白可能參與表皮成分與真皮成分間的相互作用，以激活毛芽中的干細胞，啟動生長期[25]。

另外，很多觀點認為，毛囊一旦進入生長期后，毛囊干細胞中的Wnt信號即處于被抑制狀態，以減少其增殖次數，維持其“干性”。然而Lim et al[25]發現，Wnt4、Wnt7b和Axin2在生長期毛囊的隆突部中持續表達，這表明在生長期，毛囊干細胞中的Wnt信號并沒有被抑制，Wnt/β-catenin信號處于活化狀態，然而其功能有待深入研究。

Wnt/β-catenin信號也可以通過下游轉錄因子實現其調控功能。最近，Telerman et al[26]發現，轉錄抑制因子Blimp1是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶蛋白之一，在胚胎第12.5天敲除真皮成纖維細胞中的Blimp1會遲滯毛囊發生，阻止創傷后新毛囊的形成，在表皮中過表達β-catenin能消除因Blimp1敲除而導致的表型。

4 Wnt/β-catenin信號通路在毛囊干細胞分化中的作用

Wnt/β-catenin信號通路促進毛囊干細胞進入細胞周期，并根據不同的細胞信號向相應的細胞譜系方向進行分化。實驗結果顯示，高表達β-catenin誘導毛囊干細胞向毛囊的構成細胞方向分化；β-catenin低表達或缺乏時，毛囊干細胞不再參與毛發的自我更新，而是向著上皮角質細胞的方向分化[27]。Dasgupta et al[24]在出現上述現象后，再次使β-catenin過表達，上述過程發生翻轉，即本來分化成上皮方向的細胞向形成毛囊結構的方向分化，使毛發的生長可以繼續進行。另外，有研究[28]顯示，提高穩定的β-catenin的含量，可誘導成年表皮新毛囊的形成。Lien et al[22]的研究也發現，在沒有Wnt 信號時，TCF3/4和TLE結合到普通染色體區域，該區域含一些被抑制基因，這些基因在發生毛囊干細胞命運決定時必須被經典Wnt 信號抑制。

Wnt/β-catenin信號通路中的其他關鍵蛋白也在毛囊干細胞分化調控中發揮作用。在Wnt處于激活狀態時，LEF-1最初表達于毛芽處的干細胞中，其后在短暫增殖的毛母質細胞進行定向分化并形成毛干時，在該群細胞中處于較高表達水平[22]。LEF-1敲除的小鼠出生后致死，其毛囊短小，發育停滯在胚胎第17天的水平，出生后不能產生觸須和體毛，其毛囊中雖然能夠分化形成黑色素細胞，但其功能異常，不能產生黑色素。相反，在隆突部和毛囊間表皮中過表達LEF-1，導致在表皮內形成毛芽樣結構[29]。Wnt分泌相關基因Evi/Wls也被發現在毛囊干細胞中表達，在胚胎毛囊發育時將其敲除會導致毛發稀少，表皮增厚[25]。

5 展望

關于Wnt/β-catenin信號通路在毛囊干細胞增殖中的調控作用已經有了較多研究；然而，雖然毛囊干細胞子代細胞的定向分化在新毛囊的形成中至關重要，但該方面的研究極其匱乏。另外，β-catenin和DNA結合蛋白LEF/TCF是如何識別和調控其靶基因的，仍知之甚少。LEF/TCF蛋白在不同細胞和組織中對染色體的修飾不同，提示它們的靶基因和輔因子依賴于細胞類型及所處環境。在皮膚受到損傷時，表皮中Wnt/β-catenin信號通路的激活促進創傷修復處新毛囊的產生，然而近期的研究[30]顯示，成年小鼠真皮成纖維細胞中β-catenin的上調抑制新毛囊的發生，具體原因有待進一步分析。

用毛囊干細胞構建組織工程皮膚，可用于臨床治療脫發患者的毛發再生、燒傷、燙傷與皮膚缺損患者的創面修復等。但是，早期的研究[2]證明，毛囊干細胞具有強大的增殖能力，在進行臨床移植時，其增殖和分化行為必須受到精確調控。深入研究毛囊干細胞增殖和分化的調控機制，可極大促進對毛囊干細胞生物學特性的了解和認識，為其應用于臨床提供理論基礎。