循環微小RNA-1 診療心肌梗死的研究進展

蘇彤、張曉璞、李勛綜述，楊承健審校

我國心血管病患病率處于持續上升階段，心血管死亡率高居首位。其中心肌梗死發病急而兇險，病死率高，2002～2015 年急性心肌梗死死亡率總體呈上升態勢，早期診療對改善預后十分重要[1-2]。近年來研究了各種早期診斷心肌梗死新的生物學標志物以及治療靶點，其中包括非編碼RNAs（NcRNAs），即一類高度保守，通常情況下不編碼蛋白質但在功能上調節蛋白質表達的RNA 分子[3]。目前推測這些非編碼轉錄物是生理和病理條件下基因表達的關鍵調控者，根據轉錄物長度將NcRNAs 分為短鏈、中鏈、長鏈以及環狀RNAs，其中被廣泛研究的、與心肌梗死相關的NcRNAs 是microRNAs（miRNAs，miRs）。

miRs 是一類調控基因表達、高度保守的非編碼短鏈RNA（21～24 nt），參與多種信號通路的調節，維持機體內環境穩態，并且在健康者和各種疾病患者表達譜存在明顯差異，同時穩定存在于外周血中，具備診療心肌梗死的潛力[4]。miR-1 存在心肌細胞表達特異性，是首個發現與心血管發展相關的miRs。miR-1 家族包括miR-1 亞家族和miR-206，miR-1 亞家族包括了miR-1-1 和miR-1-2 兩個轉錄本。在人類，這兩個轉錄本的成熟產物相同，具有共同序列，但其基因分別定位于2 號染色體和18 號染色體，故miR-1 亞家族表達于心肌和骨骼肌細胞，而miR-206 只表達于骨骼肌細胞。近年來，多項研究提示miR-1 直接參與調控了心肌梗死的整個病理過程，通過檢測miR-1 的表達量變化以及上游調節有助于改善心肌梗死預后[5-7]。

1 診斷心肌梗死

目前，臨床上診斷心肌梗死主要依靠患者臨床表現以及心電圖（ECG）動態改變，當二者出現診斷困難時，需聯合以肌鈣蛋白（cTn）為代表的生物學標志物，目前cTn 仍是診斷心肌梗死的“金標準”，但cTn 一般在心肌梗死發病3 h 左右才開始升高，24 h 左右達到峰值，并且在發生主動脈夾層、腎功能衰竭終末期、肺栓塞、急性心力衰竭時同樣升高，此時若存在冠狀動脈造影禁忌證或患者及家屬拒絕有創診療方式，診治將會非常棘手[8-10]。因此，有必要尋找新的診斷心肌梗死的生物學標志物。優秀的標志物應當滿足以下條件：獲取方法較易，如血液和尿液；具備心臟特異性；正常情況下，在循環系統中的表達水平很低或檢測不到，并且表達水平應與心肌梗死嚴重程度相關；如果心肌梗死發生，標志物應該在很短的時間內從損傷的心肌釋放到血液循環中，并具有相對較長的半衰期便于檢測。

早期動物研究提示，在大鼠冠狀動脈結扎1 h后即能檢測到血漿中miR-1 明顯增加，6～12 h 達峰值，24 h 明顯下降，這為早期診斷心肌梗死提供了新思路[11]。Qipshidze Kelm 等[12]通過結扎不同年齡小鼠冠狀動脈前降支制作心肌梗死動物模型，通過實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測血漿中miR-1 以及miR-133a 含量，研究提示miR-1升高更為明顯，并且年齡較大的小鼠心肌梗死后血漿中miR-1 的含量增加且與心功能減退正相關。

近年來，有關miR-1 早期診斷心肌梗死的臨床研究結果也較多，已有相關系統評價薈萃分析發表。李春雨等[13]對2010 年1 月1 日至2015 年11 月20日發表的中國患者miRs 診斷心肌梗死的24 項研究3 066 例受試者進行了分析。其中主要涉及miR-1、miR-499、miR-208 和miR-133，8篇研究報道了miR-1，采用靈敏度（Sen）、特異度（Spe）、診斷優勢比（DOR）、ROC 曲線下面積（AUC）作為評價指標，各研究之間異質性明顯（P＜0.10，I2=74.8%），合并Sen、Spe、DOR 以 及AUC 分別為0.73（95%CI：0.69～0.78）、0.84（95%CI：0.80～0.87）、24.74（95%CI：9.17～66.77）和0.8374，若miR-1 聯 合miR-133、miR-499 診斷心肌梗死，診斷效能不俗。

在另一項對亞洲心肌梗死患者展開的系統評價中，檢索了2017 年2 月公開發表的miRs 診斷心肌梗死的文獻，共納入26 項研究，包括1 973 例心肌梗死患者，1 236 例健康對照組，其中9 項研究涉及miR-1，分析所有涉及miR-1 的研究，提示各研究之間異質性明顯（P＜0.10，I2＞50%），合并Sen、Spe、DOR 以及AUC 分別為0.70（95%CI：0.66～0.74，P＜0.05）、0.81（95%CI：0.78～0.85，P＜0.001）、15.20（95%CI：7.48～30.89，P＜0.001）和0.8409，此外，通過Deeks 檢驗評估miR-1 的發表偏倚，結果表明發表偏倚可能性較低，同時比較研究較多的miRs，提示miR-499 診斷效能較高[14]。

我們的研究通過收集急性胸痛患者發病3 h 內血漿，根據診斷結果分為心肌梗死組與非心肌梗死組，同時納入同期體檢患者作為對照組，通過qRT-PCR 檢測miR-1 含量，并與cTn、肌酸激酶同工酶（CK-MB）比較，發現心肌梗死組血漿miR-1、cTnI、CK-MB 較非心肌梗死組和對照組升高（P均＜0.001）；心肌梗死患者血漿miR-1 與cTn、CK-MB均呈顯著正相關（P均＜0.001）；miR-1 的AUC 為0.905（P＜0.001），cTn 的AUC 為0.908（P＜0.001），CK-MB 的AUC 為0.795（P＜0.001），結果提示血漿miR-1 可早期診斷心肌梗死，診斷效能優于CKMB，且與cTn 相當，并且可以提供cTn 以外的診斷信息，二者聯合應用可能有助于提高心肌梗死早期診斷的準確性[15]。

2 治療心肌梗死

心肌梗死可導細胞缺氧，同時激活內皮細胞、升高活性氧水平、產生炎性趨化因子及細胞因子，致使炎癥細胞聚集在梗死區域、損傷心肌，同時激活病理性信號通路導致氧化劑及蛋白水解酶釋放，促使心肌細胞死亡、內皮毛細血管損傷及擴大梗死范圍，最后導致心臟重構、心肌纖維化等不良結局[16-17]。發病黃金時間的再灌注治療目前仍然是首選方案，Varga 等[18]首次證明大鼠血漿miRs表達譜受到缺血再灌注誘導的顯著影響，這表明miRs 參與心臟保護性信號傳導，提示特定的保護性miRs 可作為用于治療缺血再灌注損傷的潛在治療工具。已有研究發現miR-1 存在特定的基因調節功能，參與干細胞修復心肌梗死后心肌損傷，是干細胞分化的調節器，可以提高移植細胞的存活率，從而提供新的治療靶點[19-21]。

Huang 等[22]通過將豐富表達的miR-1 骨髓間充質干細胞（BMSCs）注入心肌梗死部位，可以提高 BMSCs 生存時間，其機制可能是miR-1 可抑制notch 下游靶基因Hes-1 而促進干細胞分化成心肌細胞，從而提高心肌梗死的心肌修復和改善心功能，此研究表明miR-1 可能通過調節靶基因改善干細胞治療心肌梗死效果。與此同時，相關研究表明miRs可增加心臟祖細胞（CPCs）增殖，其中miR-1 可在血管生成分化中上調，抑制Spred1 蛋白，控制生長因子激活，從而對血管生成出現負反饋作用，促使人類心臟祖細胞（hCMPCs）對這些血管生長因子敏感，分化形成新的血管，該研究同時經過遷移實驗證實了miR-1 能增加hCMPCs 的能動性[23]。

Izarra 等[24]證實了miR-1 可以抑制基因BIM、BMF 表達，從而抑制心肌細胞凋亡，同時促進CPCs分化。先前有研究證實miR-1 能促進胚胎干細胞（ESCs）向心肌樣細胞分化，通過將轉染miR-1 的ESCs 移植至心肌梗死部位，結果發現優于僅將ESCs植入心肌細胞，提示miR-1可改善心肌梗死后心功能，因過表達的miR-1 可激活p-Akt 并且抑制Caspase-3、PTEM 以及超氧化物產物從而抑制心肌細胞凋亡，抵抗氧化應激，減少心肌損傷[25]。

針對心肌梗死的早期治療以及預防并發癥極為關鍵，心肌梗死發病早期的死亡原因主要是室性心律失常。研究發現，細胞內運輸系統的失調在心血管疾病的發展中起著重要的作用，心肌梗死小鼠模型血漿中miR-1 含量明顯升高，促使與細胞內運輸相關的基因Stx6、Braf、Ube3a、Mapk8ip3、Ap1s1、Ccz1、Gja1 下調，進一步研究發現心肌梗死后小鼠心臟中和缺氧心肌細胞中Stx6 降低，進一步證實Stx6 是miR-1 的靶標；相反，Stx6 的過表達減弱了miR-1 或缺氧對PLM 和L 型鈣通道的損傷，表明miR-1 通過調節Stx6 參與心肌梗死后缺血性心律失常的發生，這為miR-1 通過調節運輸相關基因的途徑參與心肌梗死后心律失常提供了新的見解[26]。

已有研究證實縫隙連接蛋白43（Cx43）主要構成心室肌細胞的心肌縫隙連接通道，其表達下降可減慢電傳導，延長復極，減慢傳導速率，導致病理性折返回路，出現各種惡性室性心律失常，尤其是缺血性心律失常，而研究證實下調miR-1 表達，調節其靶基因GJA1、KCNJ2，上調Cx43 和Kir2.1 蛋白表達，恢復去極化的靜止膜電位，從而治療快速型心律失常，特別是通過將miR-1 特異性反義寡聚核苷酸（AMO-1）導入缺血心肌后效果顯著[27-30]。Xue等[31]通過以樹突細胞為基礎的納米載體傳遞miR-1抑制劑來早期靶向治療小鼠心肌梗死，在小鼠心肌梗死發生后黃金救治時間內對梗死部位進行治療，研究發現血管緊張素受體的亞型（AT1）在心肌梗死后24 h 內表達最明顯，并且開發了一種以AT1 靶向肽為靶點的納米載體（AT1-PEG-DGL），將其與AMO-1 相結合；靜脈給藥后的成像表明AT1-PEG-DGL 早期迅速積累在心肌梗死心臟中，顯著優于沒有AT1 靶向的對照組；最重要的是，在單次靜脈注射后發現效果顯著的抗心肌細胞凋亡作用，心肌梗死邊緣區的凋亡細胞顯著減少，梗死面積比對照組減少64.1%，提示有希望用于早期心肌梗死治療。

先前有研究顯示可溶性環氧化物水解酶抑制劑（sEHIs）能夠產生對缺血誘導的致死性心律失常的心臟保護作用[32-33]。Gui 等[34]通過結扎冠狀動脈建立小鼠心肌梗死模型，觀察到新型sEHIs t-AUCB通過抑制miR-1 的過表達，促使KCNJ2/ Kir 2.1 和GJA1/Cx43 mRNA/蛋白質的上調，進一步研究結果表明PI3K/Akt 信號通路可能參與了sEHIs 對miR-1的負調控，從而降低心肌梗死小鼠的梗死面積和誘導性心律失常的發生率。

傳統醫學也有相關研究，Wu 等[35]研究發現，穩心顆粒通過調節miR-1 和PKC 介導的信號傳導來保護縫隙連接及其組成部分Cx43 的超微結構，并且在大鼠心肌梗死模型中顯著增加心室顫動閾值，從而降低梗死后缺血性致死性心律失常的發生率。

3 展望

目前，miRs 用于心肌梗死早期診斷的研究結果不一，由于不同miRs 診斷價值不同，需要2 或3 種miRs 的組合才能優于目前的金標準cTn，致使成本相應增加，臨床應用仍然需要大規模、多中心的研究來進一步明確最有診斷價值的miR，同時加快對其穩定性、跨膜性、特異性、安全性、成藥性以及如何才能建立滿足臨床需要的檢測方法等研究，并且可以進一步細化其診斷特異性，才能使其盡早安全有效地應用于臨床，例如Li 等[36]進一步研究具備診斷冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂的標志物miRs，具有較好前景，可填補目前這方面生物學標志物的空白。從治療方面看，目前大多數研究基于基礎研究，臨床的心肌梗死模型多為永久性損傷模型，沒有考慮到再灌注治療對其效果影響，這需要逐步結合臨床，采用能反映臨床實際的缺血再灌注模型來研究，同時找出更合適的miRs 載體，尋求更可靠的靶向治療策略，以及給藥方式和給藥時機的把握，這些都需要進一步研究。