革蘭陰性菌外膜囊泡的研究進展

馮文艷 張扣興

(中山大學附屬第三醫院綜合ICU，廣州 510530)

所有活著的生物都釋放外囊泡(extracellular vesicles, EV)到細胞外環境中[1-4]。革蘭陰性菌產生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是自然不可復制的、高度免疫原性球形納米粒子，有著重要的生物學功能[5-6]。革蘭陰性菌分泌許多毒力因子以操控宿主細胞[7]，且通過一些機制使它們能在不同的環境定植和生存，例如I-VI型分泌系統已經被廣泛的研究和發表。如今一些學者提出了細胞外的結構，例如OMVs—一種額外的獨立的分泌方式，暫稱為O型分泌系統。它們起源自外膜，因此組成成分與細胞膜成分相似。這些源自外膜的囊泡可以運輸多種重要的生物分子：酶、毒素、抗原決定簇、脂多糖(LPS)和核酸[8]。因此，其所運輸多種不同的物質分子，決定了它在細胞間的交流扮演著十分重要的角色。

1 OMVs的合成與成分

革蘭陰性菌產生的OMVs是直徑為10～300nm的球形雙分子層脂蛋白，包裹的蛋白質、脂類、核酸、以及代謝物等物質，在細菌的致病機制、細胞間交流方面，發揮著至關重要的生物學功能[5,9-10]。OMVs起初被認為是細胞裂解的副產物，而后很快被證實OMVs是由革蘭陰性菌外膜(outer membrane,OM)積極分泌產生的[5,11-12]。

1.1 OMVs的合成

OMVs是由細胞膜或是細胞器膜突起的一小部分脫落而產生。在真核細胞中這一過程已研究清楚，這是選擇性的進程，精心的選擇特定的細胞成分作為囊泡攜帶的貨物以實現多種細胞功能。這一精細的過程是高度協調的系統，在囊泡形成之處，膜重組和改造，膜的曲率增大以便一個平面的膜成為一個球狀囊泡[13]。由此我們推測，原核生物的這一進程與真核生物相似。膜的曲率的改變無論對于真核細胞還是原核細胞都是極度消耗能量的過程。由平面的膜形成球狀囊泡所需的自由能(ΔG)大約是250～600kBT(kBT是熱能單位)[11]。膜的曲率變化是由外膜蛋白之一“曲率誘導蛋白(curvature inducing protein)”實現的，包裹錯誤折疊蛋白(misfolded protein)及各種膜間質蛋白(periplasmic protein)。在OMVs內，內膜相關聯的膜周質蛋白比同內膜緊密結合的蛋白質含量更高[14-15]。另外一種形成機制是，VacJ/Yrb ABC(ATP-結合型盒子)傳輸系統。在兩種完全沒有親緣關系的革蘭陰性菌流感嗜血菌和霍亂弧菌中實驗，VacJ/Yrb的缺失或低表達使兩種細菌的OMVs產物增加。脂質組學分析闡明了來源于VacJ/Yrb缺失突變型流感嗜血菌的OMVs富含某磷脂質和某些脂肪酸。結果顯示OMVs起源的機制是基于外膜上突出小葉上的磷脂的積累。這一機制在革蘭陰性菌中是高度保守的，這或許能夠解釋為何OMVs在所有生長環境下均能夠形成，而且在體內可能有重要的病理生理意義[5,16-17]。

1.2 OMVs的成分

OMVs含有豐富的外膜蛋白(如OMPs、OmpA、OmpC和OmpF)，膜間質蛋白(如AcrA和堿性磷酸酶)，以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關的毒性因子。OMVs主要由細胞外膜的成分組成，例如外膜的磷脂質(phospholipids，PLs)、外膜的蛋白、脂多糖或脂質低聚糖，也含有其他成分如周質蛋白和細胞壁成分。同時，也含有內膜蛋白、細胞質的成分、DNA、RNA、離子、代謝物和信號分子等[1,18-19]。革蘭陰性菌的細胞膜是脂質雙分子層結構，兩層膜夾著一個空間，夾著一層薄的肽聚糖。外膜是不對稱的脂質膜。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和磷脂分別是外膜小葉和內膜小葉上最充足的脂質。LPS由脂質A、多糖核心和O抗原(一個長的多糖側鏈)組成[20]。通過鈉十二烷基硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)的方法，用蛋白染色跟蹤，研究對比純化的外膜和OMVs的蛋白組成，發現二者的蛋白組成不同[21]。若OMVs是細胞裂解的隨機產物，那它的蛋白組成應與細胞膜一致。然而，在OMVs中發現一些鞭毛蛋白或是分泌蛋白是細胞膜上所沒有的[11]。因此，這些這種能量的消耗以及成分的多元化表明OMVs是一種主動的分泌過程。

2 OMVs的功能及致病機制

在各種不同環境下研究OMVs的分泌，發現周圍環境情況的能量必須很充足，才允許OMVs的分泌[22-23]。因此，OMVs成分的選擇性和細菌顯著的能量消耗，提示OMVs對于革蘭陰性菌必然發揮著至關重要的功能。

2.1 水平的基因轉化及抗生素抵抗

在OMVs中發現的DNA能夠成功的轉化到其他菌細胞中，形成一種新的DNA傳輸系統[24-25]。先前的實驗已經證明了OMVs釋放到環境中可以傳輸各種物質(如酶、毒素等)到其他細菌中[26-28]；當OMVs與受體細胞表面接觸并融合時，其包裹的物質被傳輸到受體細胞的細胞周質間隙。由此推測，這種融合也可以將其包裹在內的DNA傳輸到周質中，從而使DNA更容易進入細胞質，進而促進基因轉化[25]。

更為重要的是，被包裹在OMVs中的耐藥質粒，可以避免核酸酶的作用發生降解，從而導致抗生素抵抗基因水平傳遞到其他細菌，發生耐藥傳遞。有活性的淋病奈瑟菌和流感嗜血菌及無活性的銅綠假單胞菌和大腸埃希菌O157:H7的OMVs已被確認包裹著DNA。淋病奈瑟菌的OMVs包裹線性和染色DNA、質粒(其中一個攜帶青霉素抗性基因)以及少量的RNA。用這種OMVs與青霉素敏感的淋病奈瑟菌一同孵化，轉化株能在抗生素環境中生存。這些數據表明OMVs介導的質粒轉移能發生于淋病奈瑟菌之間[29]。大腸埃希菌O157:H7的質粒攜帶氨芐西林抗性基因(AmpR)和綠色熒光蛋白基因(pGFP)，將大腸埃希菌O157:H7的OMVs與缺乏這個質粒大腸埃希菌共同孵化，導致有熒光的轉化株，這也表明，大腸埃希菌OMVs作為DNA運輸的載體[30]。可見，OMVs有水平轉移DNA的能力，是一種新發現的自然的轉化載體，介導了細菌間耐藥的傳遞過程。

2.2 生物膜的形成

生物膜是指附著于物體表面的微生物群，是一種環境適應機制，對細菌的生存有重要意義。細菌為了逃離不利環境，黏附于固體表面，以固著方式生長。生物膜內部的細菌能避免抗生素及宿主免疫的作用，從而引發持續性感染。OMVs能夠刺激生物膜的形成。一株有生物膜形成能力的幽門螺桿菌菌株的OMVs能導致另一沒有這一能力菌株的生物膜形成[31]。若能阻斷OMVs的刺激作用，則有可能降低生物膜形成的幾率，對臨床的預后轉歸均有重大意義。

2.3 傳輸生物分子及細胞間交流

OMVs能貯存和傳輸多種多樣的生物分子[32]，形成了一個保護機制以對抗宿主的蛋白酶和抗體。例如，在周質發現的溶血基因A(clyA)是非活性的，而在OMVs中發現的是活性的低聚合的溶血基因A[33]。OMVs可以增加包裹在其中的毒素的半衰期[26]，為各種毒素提供最佳的環境。

許多細菌通過細胞外信號來交流和協調，被稱之為群體效應。疏水性群體效應分子涉及細胞與細胞間的交流，例如2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮是銅綠假單胞菌喹諾酮信號(Pseudomonas quinilonesignal, PQS)，參與了細胞間的信息傳遞，能在肺上皮細胞、支氣管上皮細胞和巨噬細胞中誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生，從而引發氧化應激，抑制肺上皮細胞的血紅素氧合1表達，顯著地誘導早期細胞凋亡，在銅綠假單胞菌感染宿主細胞時起著重要作用[34]。主動介導自身及銅綠假單胞菌產生的其他抗生素喹諾酮的包裝。OMVs攜帶的PQS能夠補足缺乏PQS的銅綠假單胞菌菌株。許多群體信號有明顯的疏水性，有實驗表明機會致病菌銅綠假單胞菌將信號分子PQS包裝到OMVs中以在群體中傳輸。在細菌群體中除去OMVs則細胞間的交流終止，且抑制了PQS控制的群體行為[25,35]。

當革蘭陰性菌感染宿主時，細菌與宿主的相互反應[11]。細胞間交流包括了種內及種間的細胞交流[26]。一些細菌能通過OMVs干擾宿主細胞的運輸途徑。例如銅綠假單胞菌通過OMVs包裹的毒素Cif細菌效應蛋白促進囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)的降解，CFRT是清除黏液纖毛所必需的。脂筏是細胞膜上一種有序的微區域，調節許多膜受體的活化，在OMVs與脂筏融合后，Cif細菌效應蛋白被釋放入宿主細胞，OMVs阻止CFTR去泛素化，導致了CFTR的溶酶體降解。且效應蛋白能夠幫助病原菌感染宿主并在宿主中定植[36]。Vanaja等[28]研究發現，LPS必須通過OMVs傳輸到細胞中。由此可見，提示OMVs能夠攜帶和釋放生物活性物質，并實現細胞間交流。

2.4 應激反應和免疫調節

研究發現細菌能夠對周圍環境做出反應，從而調整其OMVs的攜帶物質。當細菌在模仿含有沙門菌的液泡的環境下生長時，能在OMVs中檢測到傷寒沙門菌的細胞膨脹致死毒素和LPS[37]。此外，OMVs中也曾發現參與抗生素降解的酶和免疫活性化合物[38]。在應激的環境中，細菌會釋放一些不必要的或是不想要的物質，革蘭陰性菌分泌出來的OMVs攜帶有毒成分、噬菌體和未折疊的蛋白質，以減輕包膜壓力，保護自己得以避免環境情況的損害[26,32]。然而現在這一過程在大腸埃希菌中是通過哪一應激通路控制的仍然未知[39]。而在黏質沙雷菌，OMVs的產生是由溫度調控的。在實驗室環境下，黏質沙雷菌在22或30℃時產生大量的OMVs，而在37℃時產生的量很少。腸道菌的共同抗原(enterobacterial common antigen, ECA)綜合體的失活導致大量囊泡的形成，這支持OMVs在應激狀態下產生的觀點。通過突變的ECA產生高產囊泡的表型能逆轉Rcs-磷酸化反應調節器RcsB的失活，提示在這一種生物中OMVs的產生對于Rcs磷酸化的作用[40]。面對競爭性微生物，OMVs也有細菌內的作用，例如OMVs能被黏球菌利用以捕食其他細菌[41]。此外，在同一生態空間中發現競爭性微生物分泌抗菌素到OMVs內，選擇性的殺滅其他種屬的細胞[42]。細菌暴露于危險環境如抗生素、應激源、噬菌體、競爭性微生物或抗原位點已被宿主檢測到時，OMVs的分泌會增加，這很有可能是一種新的防御機制[43-44]。

許多研究闡明不同來源的OMVs通過許多不同的方式激活宿主的免疫系統[45-47]，例如百日咳桿菌通過OMVs傳輸腺苷酸環化酶毒素到宿主細胞，導致細胞內的cAMP水平的提高[48]。OMVs傳輸的物質不僅僅只有蛋白質。一些物種例如伯氏疏螺旋體分泌OMVs以傳輸脂質來調節免疫應答[49]。

2.5 腸道的微生物穩態

OMVs能調節微生物群內穩態[11,50-51]。許多類型的擬桿菌對腸道健康的有重要意義。由脆弱擬桿菌合成的多糖A(polysaccharide A, PSA)通過調節性T細胞激活宿主IL-10的分泌，這對于宿主細胞對細菌的免疫耐受的形成是很重要的[52]。脆弱擬桿菌的OMVs還能傳輸PSA到樹突細胞[53]。OMVs攜帶的PSA相較于單純的PSA能夠引發一串不同的免疫應答。這表明了OMVs的重要性，是腸道的微生物調節器的傳輸工具[54]。Elhenawy等[50]用蛋白質組學方法解釋脆弱擬桿菌和多形擬桿菌的OMVs選擇性包裝大量的碳水化合物水解和蛋白水解酶。Rakoff-Nahoum等[51]的工作表明這些OMVs包裝的水解酶對腸道的生態環境至關重要。許多擬桿菌屬通過包裹在OMVs中的水解酶都能夠消化吸收各種多糖。一種菌分泌的OMVs消化多糖的產物能夠支持其他無法分解多糖的菌種的生長，形成腸道的內穩態。這說明基于OMVs的網絡代表了在腸道菌群生態組織單位基本關系的創建，促進人類腸道的營養吸收。酶被包裹在OMVs中是能免于介質中蛋白酶的消化，說明了OMVs對腸道微生物環境穩態有重要作用。

2.6 OMVs的關鍵致病因子

OMVs能夠傳遞DNA片段、自溶酶、細胞毒素、毒力因子和多種其他生物分子[55-57]，有助于細菌建立內部的交流，并加強與宿主的相互作用。在各種生理和病理功能有突出作用，如獲取營養、誘發應激反應；傳遞毒素、黏連因子和毒力因子；逃避宿主防御系統。

以往認為在OMVs攜帶的各種物質中，蛋白是革蘭陰性細菌OMVs發揮功能的主要物質，因此，做了許多OMVs相關蛋白的研究[33,58-59]。然而近期發現，能在宿主細胞中引起免疫應答的關鍵致病因子是LPS。LPS是OMVs中最富足的成分之一，分布在外表面。此前研究發現LPS進入胞漿中能夠激活caspase-11炎癥小體，進而引起炎癥反應。然而，很多細菌本身并沒有入侵細胞的能力。Vanaja等[28]為了證實OMVs介導的細胞死亡和IL-1應答都是由LPS而不是其他成分導致的，用野生型大腸埃希菌和突變型大腸埃希菌(缺少功能性己酰脂質A，因此缺少Caspase-11活化功能)刺激骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derive macrophage，BMDMs)，結果顯示后者不能導致強烈的細胞死亡和IL-1α、IL-1β的分泌。為了了解LPS是否是OMVs功能性部分，Vanaja等[28]對OMVs用多黏菌素B做預處理，多黏菌素B是一種可以與LPS對抗的抗生素。然后測試它在炎癥因子活化上的效應。用多黏菌素B做預處理的OMVs降低了誘發細胞凋亡和IL-1應答的能力。此外，來自革蘭陽性菌的膜泡，如單核細胞增多性李斯特菌，缺少LPS，不能導致細胞死亡或是IL-1α和IL-1β的分泌。這表明，LPS是OMVs致病的關鍵組分，且OMVs是傳輸LPS到宿主細胞引發免疫應答的關鍵。

3 OMVs的提取及純化方法

提取OMVs，要除去非囊泡的物質，如鞭毛、菌毛、纖毛和蛋白聚合物等，OMVs的純度對后續相關研究有重要意義。囊泡可以從體外細菌培養或感染細菌患者的體液中分離出來。目前，一系列的實驗指南對OMVs的分離提純提供詳細的操作過程。連續的離心，過濾，密度梯度超速離心法及替代的隔離方法，如凝膠過濾等[55-57]。提取后可通過透射電鏡檢測OMVs樣本的純度。

3.1 超濾法與超速離心相結合

體液或體外細菌培養后行差速離心，上層清液通過孔徑為0.22～0.45μm的濾器和超速離心以提取OMVs[64-68]。細菌上層清液通過與給定的分子量濾膜，通常為50～100kDa，能夠去除大部分與OMVs不相關的蛋白質。超濾膜材料的選擇對于濃縮OMVs是至關重要的。膜的實際性能各不相同。有兩種方式：一種是通過惰性氣體施壓，另一種是超濾離心。前者缺點是，由于過濾的力與膜垂直，導致濾膜容易阻塞，濃縮極化效應會減慢整個濃縮進程，部分OMVs附著于濾膜之上，增加不必要的流失。而后者通過選擇設備，薄膜的方向幾乎與離心力平行，可以規避極化效應[71]。再進行超速離心以濃縮OMVs。這種方法操作麻煩且耗時較長，但得到的OMVs的純度較高。

3.2 單純超速離心法(ultracentrifugation)

單純超速離心操作簡單，耗時少，然而超速離心并不能完全分離蛋白質聚合物和膜碎片[64]。只適用于后續實驗對OMVs純度要求不高的實驗。

3.3 密度梯度離心法(density gradient centrifugation)

OMVs的脂質含量高，所以密度低于可溶性分泌蛋白、鞭毛和菌毛等，因此在密度梯度離心時OMVs遷移到較輕的層面[18]。最常用的密度梯度介質是碘克沙醇(optiPrepTM)[70]。其他密度梯度介質如蔗糖[71]和右旋糖酐[72]較少用于的OMVs的提取。粗提的OMV樣本高密度溶液混合，再梯度覆蓋低密度溶液[73]。在離心時OMVs根據浮力密度遷移到達平衡位置。離心后，從頂部或底部收集(通過刺穿管)OMVs用以后續研究。蔗糖梯度密度超速離心能夠沉淀OMVs，但仍不能移除非囊泡物質[74]。密度梯度超速離心法是目前是提取OMVs的最好方法之一[64,69]。

4 OMVs作為疫苗的應用前景

疫苗通常要求輔助劑以增加療效。傳統的輔助劑，例如明礬，以一種無法控制的方式激活免疫應答。新型的輔助劑有助于以更協調的方式指揮免疫應答。基于OMVs的疫苗現在作為一種重要的生物技術。OMVs之所以能成為傳統疫苗的替代有以下幾個原因：首先，OMVs容易被提純；其次，OMVs是天然脂質體，它的脂質組成和大小，具有增加免疫應答的輔助屬性，同時減少所需的抗原量[75]；最后，它們能夠被設計，允許外源抗原的存在[76]。

許多關于OMVs的疫苗研究說明OMVs是有前景的對抗細菌感染疫苗候選者，例如流感嗜血菌、多殺巴斯德菌、霍亂弧菌、產腸毒素的大腸埃希菌、腦膜炎奈瑟菌、百日咳博代桿菌和鼠傷寒沙門菌[77-81]。Shim等[4]研究發現無毒性的OMVs在小鼠和雪貂上能有效的增加流感疫苗的功效。無毒的fmOMVs是個有前景的佐劑能引起強健的T細胞預激，且能被廣泛適用于對抗流感病毒感染的預防措施的發展。

動物實驗證明，在小鼠身上，來源于革蘭陰性菌的OMVs已經成功地用作疫苗以抵御細菌性腦膜炎和敗血癥，而且囊泡的組成能夠被設計[82-85]。OMVs能夠通過設計囊泡的外源抗原用作疫苗的平臺。添加外源抗原到OMVs的主要優勢是使抗原保持它們的天然構象，有觸發特異免疫應答的能力，而且一個單獨的產物能用于許多的疫苗[86]。

設計OMVs作為免疫調節系統，重新編程細菌用以疫苗的傳送。現有更多研究以減少毒性但又不至于滅毒，在保證安全的情況下盡可能的保留其免疫原性。此外大規模的生產一致的自發型OMVs仍是需要關注的領域。迄今為止，大部分設計的OMVs都是單價的，即只能對抗單一病原體的；多價OMVs疫苗尚未納入研究，但它可能提高現有的OMVs疫苗的效力[6]。

此外，OMVs疫苗可以擴展到過敏的預防治療，用于針對免疫細胞對各種過敏原的耐受。OMVs已經被證明能被多種免疫細胞如巨噬細胞和樹突細胞(dendritic cell, DCs)內化。例如，Jones等[87]能夠設計腦膜炎雙球菌菌株應變產生OMVs通過DC-SIGN針對DCs。最后，結合OMVs的治療也可以實現。OMVs耦合納米粒子例如可以利用OMVs作為輔助劑的影響以及抗原表位的顯示以定位靶向細胞[6]。

5 OMVs研究展望

近10年來外膜囊泡的研究數量大幅上漲，但目前其生物起源、形成過程及功能尚沒有全面清楚的研究發表。相比于真核生物的相應的外泌體(exosomes)，目前在原核生物的OMVs研究仍較少。然而，革蘭陰性菌對人類社會的影響較大，尤其是慢性病多重耐藥菌。未來，OMVs的研究可作為突破口，對我們全面認識革蘭陰性菌和防控其感染均有重大意義。