基于線粒體功能障礙探討中醫藥治療心肌缺血再灌注的研究思路?

楊麗華，馬 春，李淑玲，劉抒雯

(1. 長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130000； 2. 長春中醫藥大學，長春 130000)

急性心肌梗死(AMI)已成為威脅人類健康的疾病之一[1]。流行病學調查顯示[2]，我國AMI的發病率為45/10～55/10萬。當心肌短暫缺血后血流灌注恢復，而復灌后缺血和組織損傷，進一步加重甚至發生不可逆性損傷的現象，這一反應稱為缺血-再灌注損傷(MIRI)[3-4]。目前的治療措施在治療AMI的同時帶來MIRI損傷。因此，MIRI發病后重視其發病機制，并進行早期干預，采取有效措施治療，對減輕MIRI損傷、防止并發癥發生及降低死亡率顯得尤為重要。

研究顯示[5]，線粒體損傷是心肌細胞結構與功能障礙的基本環節，其功能障礙是MIRI損傷的重要病理機制之一。線粒體功能障礙引起MIRI損傷，主要包括線粒體ATP生成減少、Ca2+超載、活性氧(ROS)大量產生及線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)持續開放，導致細胞凋亡[6-9]，加重MIRI損傷。前期研究表明[10-11]，中醫藥在MIRI損傷時能抑制線粒體電子傳遞鏈，調節線粒體能量代謝，抑制細胞凋亡，維持細胞內Ca2+穩態，發揮肌細胞保護作用，可作為抗心肌缺血的藥物靶點。筆者擬對MIRI損傷后線粒體的結構功能改變及中醫藥對其具體調節作用機制進行綜述，為中醫藥干預線粒體的病理過程提供治療思路，對改善急性心肌梗死患者臨床及預后具有重要意義。

1 MIRI損傷后線粒體結構功能變化及其損傷機制

1.1 心肌缺血后線粒體的變化及其損傷機制

線粒體功能障礙是導致心肌損傷的使動環節[12]。在MIRI損傷后，細胞內線粒體穩態平衡被打破，大量ROS釋放，引起ATP合成減少，使一些ATP依賴酶類如Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)功能障礙。同時細胞內pH下降、H+增多，導致Na+-H+交換增多，細胞內Na+異常增多，激活Na+/Ca2+交換蛋白(NCX)的反向模式，使胞內Ca2+超載，磷酸鹽濃度增加，mPTP開放與激活導致線粒體外膜破裂發生不可逆損傷，引起細胞色素C(Cytc)釋放，通過Caspases等凋亡因子依賴機制細胞進入不可逆的凋亡過程，加重心肌損傷[13-15]。因此，當MIRI損傷時，線粒體的損傷情況在一定程度上決定了心肌細胞死亡數量，直接決定著患者的能否存活及生存質量。

1.2 線粒體與ROS

線粒體是氧化代謝、能量生成的場所，其呼吸功能與細胞活性密切相關。正常條件下，心肌細胞線粒體低濃度的ROS控制心肌細胞分化和興奮-收縮偶聯，不會導致機體產生嚴重的損害[16]。當心肌細胞在缺血缺氧的條件下，ROS能夠引起蛋白質和脂質過氧化，重新激活線粒體電子傳遞鏈，引起氧自由基的清除系統功能降低，破壞心肌細胞結構，同時破壞心肌細胞膜、細胞器膜的流動性及通透性，使DNA、RNA交聯甚至斷裂及心肌細胞的基因結構及表達均受到影響[17-19]。此外，ROS的大量產生還引發Ca2+超載以及mPTP開放，導致Cyt-c 等一系列促凋亡因子的釋放，通過凋亡的級鏈反應引起細胞凋亡[20]。因此改善心肌缺血血供、降低氧耗、清除或對抗有害物質對心肌的不良影響，以保護心肌線粒體是提供心肌細胞能量的主要場所。

1.3 線粒體與鈣超載

生理情況下，線粒體對鈣離子的攝取主要是通過依靠作為其主要動力之一的心肌線粒體膜電位(ΔΨm)幫助實現Ca2+轉運[21]。1972年Shen和Jennings[22]發現，犬心臟冠狀動脈短暫閉塞后復灌可加速細胞內Ca2+的積聚，使Ca2+在心肌缺血再灌注損傷中的作用成為人們研究的重點。研究表明[23-24]，當Ca2+的濃度發生增加幅度稍高，會促使發生氧化磷酸化線粒體現象，一定程度上刺激線粒體基質的Ca2+攝入，Ca2+量明顯增加，Ca2+超載發生于線粒體基質中，則會發生消除ΔΨm效應。當再灌注時心肌細胞重新恢復氧供，細胞內Ca2+促進黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤氧化酶，使ROS生成增多，加重酸中毒，大量乳酸堆積反過來使線粒體膜通透性改變，線粒體結構破壞，線粒體內Ca2+以磷酸鹽形式沉積，影響線粒體的氧化磷酸化過程，同時膜磷脂的降解釋放大量產物如花生四烯酸、溶血磷脂，增加膜通透性，加重了線粒體內Ca2+超載[25-26]，使心肌功能進一步損傷。因此，減輕或防止線粒體 Ca2+超載和線粒體損傷，對保護缺血再灌注心肌細胞有重要意義。

1.4 線粒體與線粒體膜通透性轉移孔MPTP

mPTP是位于線粒體內的非選擇性、高導電性復核孔道[27]，是線粒體進行氧化應激、細胞呼吸、合成ATP等生命活動的必要條件，也是影響線粒體穩定性和細胞功能的關鍵因素[28]。當外界刺激較輕時，少量線粒體上mPTP一過性開放，線粒體內Ca2+釋放，ATP仍可由部分未受損的線粒體提供。嚴重損傷時，高通透性開放狀態使 ATP合成受阻，線粒體膜電位下降、細胞色素C等前凋亡蛋白釋放[29]，不可逆的MIRI損傷與mPTP的激活開放密切相關[30]。在MIRI早期，ATP合成分解障礙使線粒體膜上的mPTP進一步開放。同時，呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯，線粒體跨膜電位消失，H+自由在線粒體內膜兩側達到平衡，破壞線粒體質子梯度、膜電位消失，引起線粒體內離子平衡紊亂，引起外滲的細胞色素可活化，可活化凋亡執行蛋白并最終導致心肌細胞調亡[31-32]。因此，在MIRI早期有效抑制線粒體mPTP的開放，可作為MIRI損傷新的治療策略。

1.5 線粒體與細胞凋亡

細胞凋亡病理條件下可促進細胞死亡[33]。細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要原因和表現形式之一，線粒體在調節細胞凋亡過程中發揮著重要作用[34]。線粒體在凋亡信號的刺激下，通透性增大，膜電位丟失，促進凋亡因子從線粒體釋放到胞質中，細胞凋亡裂解所釋放的ROS又引起鄰近細胞的連鎖式凋亡反應。此外，線粒體內鈣超載及ROS 的集聚導致mPTP大量開放，線粒體內膜完整性破壞，ATP合成功能障礙，促進細胞凋亡因子釋放，加重心肌缺血再灌注損傷，因此線粒體功能障礙與否與心肌細胞的凋亡密切相關。當MIRI損傷后產生的ROS、Ca2+超載等病理變化以及線粒體損傷引起的mPTP開放，線粒體跨膜電位持續性降低，使線粒體向胞質釋放凋亡因子Cyt-c和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase)等凋亡信號啟動，這些因素雖然不能直接引起細胞凋亡，但可通過一定的信號傳遞方式激活生存或死亡相關基因，執行死亡功能[35-37]。

2 中醫藥對心肌缺血后線粒體功能的保護作用及機制

2.1 以線粒體整體功能為關鍵作用靶點的中藥單體及復方

在MIRI損傷過程中，Ca2+超載和活性氧大量產生會造成mPTP不可逆開放。治療過程中，抑制mPTPT的激活與開放對維持線粒體穩態對防治MIRI具有重要意義。范宗靜等[38]建立MIRI大鼠模型后發現，模型組線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平均顯著升高，經黃芪多糖處理后線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平明顯降低，證實黃芪多糖通過減輕線粒體內鈣超載減少ROS產生，降低膜電位水平及抑制mPTP過度開放，從而減輕MIRI對線粒體膜結構的破壞，進而保護心臟舒縮功能。此外，體外細胞(HCMEC)也證實，黃芪多糖干預后AKT和ERK1/2介導的細胞傳導通路激活，進一步證實黃芪多糖對MIRI后線粒體的整體保護作用[39]。周春剛[40]等發現，當歸補血湯預處理缺氧心肌細胞，細胞早期凋亡率和ROS水平均明顯降低，表明當歸補血湯能夠提高細胞耐受氧化應激，抑制缺氧復氧損傷導致的細胞凋亡。中醫藥從線粒體整體保護出發，通過抑制鈣超載，減少ROS產生，降低膜電位水平及抑制mPTP過度開放等多靶點治療，進而保護心臟舒縮功能、維持心臟穩態具有重要意義。

2.2 以線粒體內鈣超載為關鍵作用靶點的中藥單體及復方

MIRI損傷時，細胞中因缺血缺氧而進行無氧糖降解，導致細胞內Na+外流、Ca2+內流引起鈣超載[41]。朱寧等[42]發現，缺氧組心肌細胞肌漿網鈣泵(SERCA)活性下降，細胞內鈣離子濃度增加，紅景天苷治療后，心肌細胞SERCA活性增加，細胞內鈣離子含量顯著降低，說明紅景天對缺氧的乳鼠心肌細胞損傷的保護可能與其能升高SERCA活性、減輕鈣超載有關。宋麗華等[43]發現，白藜蘆醇組線粒體中琥珀酸脫氫酶(SDH)、鈉鉀腺苷三磷酸酶(Na+-K+-ATPase)、鈣腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATPase)的活性明顯提高，線粒體內鈣離子濃度明顯下降，mPTP開放程度減小，線粒體膜電位增高；Ca2+-ATPase、熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在mRNA或蛋白水平上的表達均有所增加，證實白藜蘆醇保護MIRI可能是通過增加心肌組織中Ca2+-ATPase、HSP70mRNA蛋白的表達，從而提高線粒體Ca2+-ATPase的活性，產生對大鼠心肌缺血再灌注損傷時線粒體的保護作用。因此，中醫藥抑制Ca2+的作用機制可能與影響細胞膜上鈣通道的開放，干預Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase，提高心肌肌質網鈣泵活性及雙重細胞和線粒體鈣濃度，發揮心肌線粒體保護功能。

2.3 以線粒體內氧自由基為關鍵作用靶點的單體及復方

氧化應激損傷在心肌缺血尤其是再灌注時起關鍵作用。王佳等[44]研究發現，熊果酸可明顯減少心肌丙二醛(MDA)和脂質過氧化物(LPO)的表達水平，以及血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量，增加心肌過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及血清高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)的含量，提示熊果酸可通過抑制氧化應激和脂質過氧化反應減輕ROS誘發的線粒體功能障礙，從而減輕MIRI損傷。關鳳英等[45]證實，黃芪甲苷能夠顯著降低MDA含量和乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量，增強SOD活力，并能改善細胞器形態，激活線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitoK ATPC)，使線粒體信號傳導通路受抑制，最終減少心肌細胞凋亡。保善錄等[46]用4味辣根菜湯散給藥后，大鼠SOD活性升高，MDA含量降低，其對MIRI損傷心肌的保護作用可能是通過促進抑制自由基的產生，增強自由基清除劑的功能，從而維持心肌細胞氧化和抗氧化的動態平衡，發揮保護心肌細胞保護作用。因此，中醫藥針對氧化應激的作用機制可能與抑制自由基產生、提高線粒體抗氧化能力損傷密切相關。

2.4 靶向線粒體內mPTP的中藥單體及復方

mPTP異常高水平開放可導致能量生成障礙及誘導細胞死亡。李劍等[47]建立大鼠MIRI損傷模型后發現，再灌注期心肌細胞上的線粒體 mPTP呈開放狀態，給予葛根素治療后恰好能抑制線粒體mPTP的開放，減少心肌細胞Caspase-3的大量釋放，從而能抑制心肌細胞的大量凋亡，同時葛根素組的自噬特異性標志物LC3 II、Beclin1顯著減少，說明葛根素減少心肌缺血再灌注梗死面積，其可能的作用機制是抑制線粒體mPTP開發，從而減輕心肌細胞大量和自噬性死亡。賀永貴[48]等結扎冠狀動脈進行心肌缺血建立離體MIRI模型，給予黃芪甲苷治療后心功能顯著改善，心肌梗死面積明顯減少，線粒體腫脹程度縮小，同時給藥后使再灌注5 min和10 min的GSK-3β磷酸化明顯增加，說明黃芪甲苷通過使GSK-3β失活而抑制mPTP，證實黃芪甲苷對MIRI保護作用可能與抑制GSK-3β 活性、進而阻止mPTP開放有關。李玉紅等[49]將參麥注射液與丹參注射液聯合應用發現，離體心臟mPTP更容易開放，表明其含有較多未開放的線粒體，提示其聯合應用在體時可能減少誘發mPTP開放的因素，使再灌注期間活性氧類物質的產生及線粒體鈣超載降低，從而“間接”抑制mPTP開放，減少其凋亡或壞死的發生，保護線粒體的完整性。中醫藥能夠以mPTP為靶點治療mIRI損傷，其具體作用機制可能與通過作用于mPTP結構成分，直接抑制mPTP開放及通過降低mPTP開放誘導劑的水平間接抑制mPTP開放有關。

2.5 靶向線粒體內細胞凋亡中藥單體及復方

線粒體內細胞凋亡是MIRI損傷的最終結果，PI3K-Akt信號通路具有調節細胞分化、增殖、凋亡等作用，是調控心肌細胞存活的一個重要通路[50]。張月紅[51]等在研究丹參飲提取物A抗心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡的作用機制時發現，丹參飲提取物A組心肌細胞凋亡指數比模型組明顯降低，Bcl-2、GSK-3β蛋白表達水平明顯升高，Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表達水平明顯降低，同時P-Akt蛋白表達增加，說明PI3K-Akt 信號通路參與了心肌缺血損傷的發生過程，丹參飲提取物對心肌缺血細胞凋亡的干預作用可能是通過PI3K-Akt信號傳導通路實現的。于鑫鑫等[52]發現，甘草酸能顯著降低MIRI細胞凋亡率，減少腦組織MKK/JNK信號通路蛋白[絲分裂原活化蛋白激酶4/7(p-MKK4/7)]、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(p-JNK1/2/3)、Caspase-8、Bax、Caspase-3表達，提高Bcl-2表達水平，同時甘草酸組較模型組心肌細胞水腫程度輕且炎性細胞少。林凱旋等[53]制備大鼠MIRI模型，觀察益氣化瘀方對心肌細胞相關凋亡蛋白的影響，發現益氣化瘀方能明顯減少促心肌細胞凋亡的相關調節蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表達，增加抑制心肌細胞凋亡相關調節蛋白Bcl-2的表達，發揮心肌保護作用。因此，中醫藥能夠抑制細胞凋亡因子的產生，提高抗細胞凋亡因子活性，并通過調控多細胞間信號通路發揮抗凋亡作用。

3 思考與展望

基于線粒體的整體結構完整和功能穩定，對于MIRI治療提供了新的靶點及研究思路。中醫藥具有多組分、多靶點、多環節、多途徑的優勢和特點，隨著中醫藥抗MIRI作用機制的深入研究，調控線粒體結構功能被證實是中醫藥對心肌保護作用的機制之一。上述研究證實，中藥單體及復方均能調控細胞內氧化應激，減少Ca2+超載，穩定線粒體結構功能，抑制mPTP開放，最終抑制細胞凋亡而減輕MIRI損傷。但現有研究對線粒體結構功能及中醫藥治療作用機制尚未深入研究及系統評價，以下問題有待解決：一是大多數仍停留在單一機制的研究，同一指標多次檢測、同一中藥單體及復方反復驗證，降低了中藥在治療MIRI的突出優勢；二是在相關蛋白信號通道及基因等深層次方面研究較少，不能很好地體現中藥對MIRI作用機制的多環節、多途徑、多靶點特點；三是對中藥作用機制的研究大多借鑒西藥的研究模式，在中醫辨證方面的研究極少，忽視了中醫藥理論的指導；四是實驗動物模型的制備僅具有MIRI疾病的特征，而未按中醫學“證”出發，與辨證論治不相符，在臨床運用中有一定的盲目性；五是未深入研究線粒體與其他組分間相互影響機制，中醫藥調控線粒體穩態及怎樣將現有的研究成果與臨床實際結合更好地解決實際應用，可能都是今后需要研究和解決的問題。因此，基于中醫“整體觀念，辨證論治”的理論，開發療效確切的新藥，重視線粒體與其他影響MIRI組分之間的相互作用，將西醫辨病與中醫辨證相結合， 對病、 證、方藥有機結合研究，同時加強miRNA基因調控等細胞分子層面對線粒體代謝等基礎研究，探索其相關調控機制和信號分子改變，闡明其防治MIRI的物質基礎和主要作用機制，在臨床研究中進行更為科學的設計，擴展更大的樣本量，進行分類系統研究，提高對MIRI機制的研究，并能夠為臨床治療MIRI提供潛在的治療策略和理論依據。