腎衰康灌腸液通過內質網應激對HK-2細胞缺氧/復氧損傷的保護作用及機制研究?

羅芯怡，葉乃菁，鄧榮榮，李明權

(1.成都中醫藥大學，成都 610075； 2.成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610075)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見的急危重癥，其死亡率高，缺乏有效的治療措施，臨床以對癥處理和腎臟替代治療為主，缺乏有效的治療藥物，嚴重威脅影響患者的生命安全和生存質量。缺血性急性腎損傷是急性腎損傷的主要類型，占75%以上[1]。研究表明，內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)引起促生存信號通路和促凋亡信號通路調控失衡，導致腎小管上皮細胞過度凋亡，是缺血性急性腎損傷發生發展的關鍵機制[2-4]。ERS蛋白如內質網功能調節蛋白(GRP78)、內質網源性轉錄因子(CHOP)等表達增加，可提高ERS狀態下細胞處理未折疊蛋白或抵御其他細胞應激的能力[5]。

腎衰康灌腸液是目前以急性腎損傷為適應癥的惟一上市應用的中成藥，具有確切的臨床療效，但腎衰康灌腸液在細胞層面對急性腎損傷的治療作用研究缺乏。為驗證該藥的有效性，本實驗采用體外培養人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)缺氧再復氧模型模擬腎缺血再灌注損傷，以排除在體各因素的影響，觀察細胞凋亡情況及GRP78、CHOP表達的變化，探討腎衰康灌腸液是否有抗內質網應激治療缺血性急性腎損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭SPFWistar級大白兔6只，雌雄各半，體質量 2.0～2.2 kg，購自達碩公司[合格證號SCXK(川)2012-11]，動物分籠飼養，保持室內相對濕度(60±5)%，溫度20～22 ℃，室內12 h明暗自動切換，自由飲水，標準飼料喂養。

1.2 實驗藥物

實驗藥品：腎衰康灌腸液(大黃、黃芪、丹參、紅花組成)，20 ml×10支/盒，海南天元制藥廠提供(批號Z46020083)，常溫保存。對照灌腸液：PBS溶液，成都中醫藥大學中心實驗室配置，保存于室溫中。

1.3 試劑及儀器

實驗試劑： CHOP、GRP78抗體均由Abcam公司提供，HK-2細胞、DMEN/F12由Gibco公司提供， CFSE及PI染液由Sigma公司提供，細胞凋亡檢測試劑盒由BD公司提供，活性氧檢測試劑由Invitrogen公司提供等。 實驗儀器：正置、倒置熒光顯微鏡(BX51，OLYMPUS/日本)，流式儀(bio-rad)，離心機(ST16R，Thereto/美國)，超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，高頻數控超聲波清洗器(KQ-200TDB，昆山市超聲儀器有限公司)，電泳系統(PowerPac Basic， Bio-rad/美國)，恒溫震蕩箱(QYC-200型，上海福瑪)， RT-PCR儀(PIKORed96，美國ThermoFisher儀器有限公司)、冰柜(DW-40 W 100，海爾)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 含藥血清的制備及標本采集 動物飼養于成都中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，購買后適應性喂養1周，按體質量隨機分為正常血清組、空白組、腎衰康灌腸液高劑量組3組各2只。

正常血清組給予正常喂養；腎衰康灌腸液高劑量組給予腎衰康灌腸液灌腸，藥量按人與動物體表面積換算得出，高劑量為9.617 ml·kg-1[6-7]；空白組給予等量PBS溶液灌腸。腎衰康灌腸液高劑量組和空白組每天灌腸量分4次完成，于第4天上午灌腸1次后，3組兔子分別采血離心取上清、過濾除菌。

以腎衰康灌腸液高劑量組血清與正常血清組血清按比例混合，制備腎衰康灌腸液中劑量組血清(含高劑量組血清50%)和腎衰康灌腸液低劑量組血清(含高劑量組血清25%)。將空白組、腎衰康灌腸液高劑量組、腎衰康灌腸液中劑量組、腎衰康灌腸液低劑量組各組血清冷存。

1.4.2 細胞培養、分組及處理 人腎小管上皮細胞株(HK-2細胞)以含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養液在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養，同步化24 h。

1.當前在小學生英語的教學領域，有一大部分教師沿用傳統英語教學方法，不僅在方法上被時代所淘汰，在教學理念上也非常陳舊和落后，很多農村的教師在新式的教學方法方面幾乎沒有涉及過信息化教學模式，在他們的教學過程中根本無法有效地在課堂上吸引學生的注意力。在這種情況下，學生學習積極性很難被充分調動。

取2組細胞，空白組常規培養，不預缺氧/復氧處理，也不加含藥血清處理；模型組細胞密封處理，以模擬體內細胞缺血再灌注損傷過程，然后檢測從造模開始(0 h)0、1、2、3、4、5、6、7 h各組細胞內ROS水平，以推測細胞缺氧復氧的造模時間。

造模時間確定后，隨機分為正常培養組、缺氧/復氧組、低劑量組、中劑量組、高劑量組5組。正常培養組加入空白組兔血清(含PBS血清)，其余4組密封處理，待造模時間解除密封，以模擬體內細胞缺血再灌注損傷狀態。缺氧/復氧組再加入空白組兔血清(含PBS血清)，腎衰康灌腸液各劑量組分別再加入其高、中、低劑量含藥血清。以上各組血清的體積分數為 0. 1，孵育48 h，并分別于0、4、8、12、24和48 h檢測相關指標。

1.4.3 觀察指標與方法 細胞ROS檢測:測定細胞在造模結束并加入相應血清后在加蓋并膠帶密封7 h后0、1、2、3、4、5、6、7 h細胞內ROS水平，以推測細胞缺氧復氧的造模時間。操作方法：稀釋ROS原液，收集細胞加入一定量的ROS工作液。37 ℃培養箱孵育30 min后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光；吸棄ROS染液，PBS清洗2次，加入Hoechst33345染液(250X，藍光)，37 ℃培養箱孵育5～10 min，PBS清洗觀察熒光。

細胞損傷/凋亡率檢測:以CFSE/PI法、流式細胞分析聯合Annexin V-FITC/PI法檢測5組細胞造模后分別加入空白組、對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組5組血清后0、4、8、12 h的細胞凋亡/死亡情況。操作方法：收集細胞，細胞懸浮液準備，分別染色加入等體積CFSE、 FITC Annexin V和PI工作液，混合均勻于37 ℃孵育10 min，PBS清洗，于熒光顯微鏡下觀察染色結果。

內質網應激相關指標基因檢測:采用RT-qPCR法檢測對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時細胞內ERS標志分子GRP78、CHOP的mRNA。操作方法：將組織塊剪成小塊，加入定量的Trizol細胞裂解液，然后用超聲細胞粉碎儀處理，細胞裂解液變渾濁即可。對于細胞：用PBS溶液將細胞清洗1次，每孔加入400 μL trizol細胞裂解液，吹打使細胞完全裂解；分離，沉淀為RNA，洗滌、溶解RNA，RNA轉錄為cDNA(引物序列：Actin：上游：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，GRP78:上游：5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′，下游：5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′，CHOP：上游：5′-GGAAACAGAGTGGTCATTCCC-3′，下游：5′-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC-3′)，37 ℃孵育40 min，終止反應，85 ℃孵育5 min，cDNA產物稀釋20～50倍后使用，保存于-20 ℃，然后將PCR板置于RT-PCR儀上運行。

內質網應激相關指標蛋白檢測:半定量western用于檢測對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時細胞內ERS標志分子GRP78、CHOP的蛋白表達情況。操作方法：收集蛋白樣品配制凝膠，上樣與電泳，按順序加入5 μL maker，5-10 μL樣品，5 μL loading buffer。加入電泳緩沖液，插好正負極，用90 V 跑完濃縮膠后，調節電壓至130 V跑分離膠，待樣品接近凝膠底端時關閉電壓；轉模封閉，將PVCF膜在甲醇中浸泡2 min，然后用轉膜液清洗1次(1000 ml轉膜工作液的配制：100 ml 10×的轉膜液+200 ml 的乙醇 +700 ml的二次水)， 4 ℃ 90 V跑1～1.5 h，BSA溶液37 ℃孵育0.5～1 h，不要清洗直接進行一抗孵育。一抗用PBS-T(含0.1%的Tween 20的PBS溶液)按1∶1000稀釋，4 ℃過夜或室溫孵育1.5 h。然后PBS-T清洗3次，每次5 min。二抗孵育，用PBS-T(含1‰的Tween-20)按1∶1000稀釋，室溫或37 ℃孵育1 h，然后PBS-T清洗3次，每次5 min，最后顯影及定影。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 細胞ROS檢測

圖1～3顯示，正常組細胞內未觀察到綠色熒光；隨著缺氧時間的延長，3 h時模型組(缺氧處理)出現綠色熒光，5 h時模型組ROS綠色熒光信號明顯增強(箭頭提示處)，細胞內活性氧達到最高值；5 h后細胞凋亡明顯，無法進行后續實驗，故細胞缺氧復氧時間點為密封5 h。

2.2 CFSE/PI染色實驗

圖4～8顯示，造模0 h時的CFSE/PI染色結果表明，各組中紅色亮點沒有明顯增加，即細胞死亡率未出現明顯變化；4 h時各組細胞死亡率明顯增加，表明細胞模型成功；而在含藥血清處理造模細胞12 h時，藥物組細胞死亡率明顯低于對照組和PBS組，其中高劑量組最為明顯，表明該藥物的藥效具有濃度依賴性；隨著培養時間的延長，各組細胞死亡率逐漸回到正常水平，造模效果消失。

圖1 造模0 h時ROS檢測比較(×40)

圖2 造模3 h時ROS檢測比較(×40)

圖3 造模5 h時ROS檢測比較(×40)

圖4 含藥血清處理造模細胞0 h后CFSE/PI染色結果比較(×40)

圖5 含藥血清處理造模細胞4 h后CFSE/PI染色結果比較(×40)

CFSE/PI染色結果表明，該含藥血清對缺血再灌注引起的細胞凋亡/死亡有一定的抑制效果，高劑量組藥效最佳。CFSE/PI染色法表明，本次實驗HK-2細胞缺血再灌注損傷模型建立成功。隨著造模后時間延長，細胞凋亡逐漸增加直到24 h，各組凋亡率與空白對照組相當，此時藥物作用失效。我們推測腎衰康灌腸液抑制細胞凋亡與藥物劑量有關。

2.3 流式細胞分析細胞凋亡情況

圖6 含藥血清處理造模細胞12 h后CFSE/PI染色結果比較(×40)

圖7 含藥血清處理造模細胞24 h后CFSE/PI染色結果比較(×40)

注：*P<0.05，**P<0.01圖8 含藥血清對各組處理細胞0～24 h、CFSE/PI染色的影響

圖9、10顯示，為進一步探索腎衰康灌腸液含藥血清對缺氧/復氧損傷HK-2細胞的凋亡影響和量化相關指標，我們采用Annexin V-FITC/PI聯合流式細胞術，定量分析各組細胞在造模后不同時間點細胞凋亡/死亡率。造模0 h時，各組細胞的凋亡/死亡率均未出現明顯變化；從0 h開始到12 h，對照組和PBS組均能檢測到大量的細胞凋亡/死亡率；而在24 h后，細胞凋亡/死亡明顯恢復，造模效果喪失(48 h數據未展示)。在12 h，3個含藥血清組均有明顯的凋亡/死亡抑制效果。

上述結果顯示，在HK-2細胞中含藥血清對缺血再灌注引起的細胞凋亡/死亡具有明顯的抑制效果，且這一效果可以持續到缺血再灌注損傷影響消失。

2.4 RT-PCR實驗

圖11、12顯示，在檢測基因及蛋白時，因正常組未缺氧/復氧造模檢測無意義，故檢測時未再檢測正常組相關指標，對照組即可對照。含藥血清處理模型細胞4 h后，GRP78、CHOP基因表達均下降發生明顯變化；從4 h到12 h GRP78升高表達，逐漸恢復至正常水平。相對于PBS組，低、中、高劑量組對HK-2細胞中GRP78、CHOP的基因表達(P<0.05)差異有統計學意義。上述結果顯示，含藥血清抑制缺血再灌注損傷模型HK-2細胞凋亡與內質網應激有關。

2.5 WB實驗

圖13顯示，GRP78和 CHOP蛋白表達在空白組及實驗組，無論高、中、低劑量改變不明顯，說明腎衰康灌腸液改變蛋白變化不明顯，對抗內質網應激通路中GRP78、CHOP蛋白表達不明確。其中CHOP條帶下出現非特異性條帶，可能是蛋白降解后產生的小片段堆積在膠底導致，對最后結果無明顯影響。

圖9 流式細胞術檢測Annexin V-FITC/PI細胞凋亡/死亡率

注：*P<0.05圖10 不同時間點各組處理的細胞凋亡/死亡率比較

注：*P<0.05圖11 相對于PBS組，低、中、高劑量組對HK-2細胞中GRP78的基因表達

注：*P<0.05圖12 相對于PBS組，低、中、高劑量組對HK-2細胞中CHOP的基因表達

注：條帶分子量β-actin：45 kDa；CHOP：27 kDa；GRP78:78 kDa圖13 CHOP、GRP78蛋白表達比較

3 討論

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見的急危重癥，其死亡率高[8]，目前尚無有效的治療藥物，嚴重威脅患者的生命安全和生存質量。成都中醫藥大學研制的腎衰康灌腸液遵循中醫“清熱解毒”“活血化瘀”“益氣利尿”治則，由大黃、黃芪、丹參、紅花組成。方中大黃通下能使病邪有出路，使堆聚在人體的水分和廢物能從腸道排出，有助于病人渡過少尿、無尿的危急階段[9]。同時大黃改善代謝作用顯著，現代中藥藥理研究學表明，大黃有利尿和改善腎功能的作用，可以減少腸道對氨基氮的吸收，利用氨合成蛋白質，抑制體蛋白分解，促進尿素和肌酐隨尿液排出體外[10-12]。黃芪能扶正固本、利尿消腫，具有增強機體免疫、雙向調節血壓、降低蛋白尿、擴張外周血管及增強非特異性免疫作用[12]。其主要成分之一黃芪甲苷，能明顯減少缺血再灌注時GRP78的表達，通過抑制ERS保護大鼠缺血/再灌注器官[13]；紅花、丹參具有活血化瘀的功效，可以擴張血管，解除微血管痙攣，特別是腎小動脈痙攣，防止血細胞聚集，改善微循環，使腎血流量恢復[14-15]，抑制人腎成纖維細胞增殖并促進機體代謝，達到改善腎間質纖維化的作用[15]。本藥臨床治療急性腎損傷有效率一直在80%以上[16]。

本實驗因條件有限無三氣培養箱，故采用檢測ROS，以推測細胞在缺氧條件下的活性情況，同時證明造模成功。實驗結果顯示，腎衰康灌腸液對體外培養人腎小管上皮細胞株(HK-2細胞)缺血再灌注損傷后細胞凋亡/死亡有明顯改善，驗證了腎衰康灌腸液不僅臨床治療急性腎損傷有效，從細胞學角度證明對缺血性急性腎損傷也有治療作用。

缺血性AKI是主要類型[1]，其主要特征是腎小管上皮細胞的凋亡。研究表明[2-4]，內質網應激引起促生存信號通路和促凋亡信號通路調控失衡，導致腎小管上皮細胞過度凋亡，是缺血性急性腎損傷發生發展的關鍵機制。

細胞在多種理化因素(缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調、化學毒物等)的刺激下，內質網腔內會出現蛋白質的錯誤折疊及未折疊蛋白質的聚集，這種內質網內在功能紊亂的狀態稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[17]。內質網為適應正在改變的環境或重新建立一個正常的ER功能，將逐漸形成一種稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)的信號通路[18]。UPR由3種ER感應蛋白介導，分別是PERK、ATF6和IRE-l，在未發生應激時都以無活性狀態與內質網分子伴侶GRP78結合。錯誤折疊或未折疊蛋白的積聚使GRP78從3種感應蛋白上解離，轉而去結合錯誤折疊或未折疊蛋白。解離后的感應蛋白被活化并啟動UPR，包括早期蛋白質合成的廣泛抑制、內質網分子伴侶和折疊酶的轉錄激活等一系列反應，從而降低錯誤折疊或未折疊蛋白在內質網內的積累，恢復內質網的正常功能，是一個促生存信號途徑，故GRP78表達的上調是ERS的標志，在應激條件下對細胞起保護作用[19]。

PERK、ATF6以及IRE-l信號不僅能夠啟動ERS的生存途徑，當過強或時間過長的ERS導致ER功能受損時，這3條信號通路同樣能夠啟動由ERS所介導的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡，去除受損傷的細胞。ERS引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱之為內質網相關性死亡(ER-ssociated death，ERAD)途徑[20]。目前發現，ERAD相關途徑有3條，即內質網源性轉錄因子(CHOP)、天冬氨酸特異性半肌氨酸蛋白-12(Caspase-12)和c-Ju氨基末端激酶(JNK)[21-23]。故臨床研究內質網應激通過CHOP、Caspase-12、JNK 3條通路研究。其中CHOP在真核動物的組織細胞中廣泛存在，其編碼蛋白與多種細胞功能活動(如增殖、分化、凋亡)密切相關。據研究報道，CHOP基因可通過抑制Bcl-2(凋亡負調節蛋白)誘導細胞發生凋亡，也可通過與促凋亡死亡受體5(DR5)基因5'翼狀區結合而增加后者蛋白的表達，而后者是激活caspase家族的重要分子[24-25]。在CHOP基因過表達以及運用CHOP敲除小鼠的實驗研究中發現，CHOP蛋白在內質網應激中可誘導細胞周期阻滯及凋亡[26-27]。正常情況下，CHOP幾乎不表達，內質網應激時可通過IRE-1、 PERK和ATF6的活化促進CHOP的大量表達，最終引起細胞凋亡。

最后實驗結果可見，該實驗模型存在內質網應激反應的激活，且內質網應激相關通路參與引起細胞凋亡(GRP78，CHOP基因表達在不同組別有明顯不同)，腎衰康灌腸液可減少HK-2細胞凋亡率，減輕腎缺血再灌注損傷。但是檢測對照組及實驗組內質網應激通路中的GRP78、CHOP蛋白表達無明顯變化，推測腎衰康灌腸液減輕腎缺血再灌注損傷的機制可能不是通過內質網應激通路中的GRP78、CHOP起作用，可能檢測蛋白應考慮從IRE-1、 PERK和ATF6檢測，或腎衰康灌腸液治療是通過內質網應激中其他信號通路起作用的，有待進一步深入研究。

綜上所述，本實驗證明中藥腎衰康灌腸液確實有抗內質網應激治療HK-2細胞缺氧/復氧損傷的作用。該中藥不僅臨床有效，且驗證了中藥復方在細胞層面治療急性腎損傷的有效性，為急性腎損傷的中醫治療提供了新的理論依據。