中藥石香膏對糖尿病大鼠慢性難愈合創面RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表達影響的研究?

凌一鳴，費 冀，張開偉，周一夫，沈馮君

(1. 貴州中醫藥大學，貴陽 550002； 2. 貴州省中醫醫院骨傷科，貴陽 550001)

慢性難愈合創面是指各種因素導致傷口不能正常愈合，且皮膚解剖和功能的完整性不能在大約1個月內實現的疾病。主要病因包括糖尿病潰瘍、褥瘡、小腿靜脈潰瘍和手術部位感染等[1-3]。該病發病率高、病程長、治愈率低，給患者及社會帶來了沉重負擔。據統計，該類患者占總住院患者比例的1.7‰，平均住院花費1.2萬元，但僅有一半患者可以痊愈[4]。 在全國名老中醫沈馮君教授的經驗基礎上，貴州省中醫醫院院內制劑“石香膏”經過大量的臨床研究證實，對于慢性難愈合創面修復具有顯著療效[5-7]。先前有關基礎研究已證實，中藥石香膏能夠通過刺激創面內細胞產生內源性生長因子，激發成纖維細胞增殖，進而促進創面的修復[8]。本研究通過建立糖尿病潰瘍大鼠模型，從RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表達水平的變化觀察石香膏外用對于創面愈合的干預作用，更深層次探究其作用機制，為該藥的進一步研究及臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 石香膏制備過程：將乳香 150 g、沒藥 150 g、赤石脂 150 g、梔子150 g、煅龍骨 150 g、冰片150 g一同打成細粉末狀以方便制備。將約2 L麻油倒入鍋中加熱，充分加熱至冒煙后，緩慢加入爐甘石500 g并充分攪拌，防止鍋內液體起泡溢出。待爐甘石攪拌均勻后，分別倒入已經磨好的乳香粉、沒藥粉、赤石脂粉、梔子粉、煅龍骨粉、冰片粉，持續充分攪勻，約1 h熬成面糊狀約即可，此時加入約200 g蜂蠟，待冷卻后石香膏即制備完成。此操作于貴州省中醫醫院中藥制劑室制備。貝復濟(重組牛堿性成纖維細胞生長因子溶液)購自珠海億勝生物制藥有限公司。

1.1.2 實驗動物 50只清潔級雄性SD大鼠，體質量300～350 g，由貴州醫科大學實驗動物中心(貴州省實驗動物工程技術中心)提供(生產許可證號SCXK(黔)2012-0001)，于貴州醫科大學實驗動物中心實驗室分籠飼養。

1.1.3 主要試劑、儀器 免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-biotinperoxidase method，SP)試劑盒；核因子-κB P65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#8242，1∶1000 稀釋)，核因子-κB pP65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#3039，1∶1000 稀釋)，內皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)一抗(#9572，1∶1000稀釋)購自武漢博士德公司；熒光定量PCR試劑(qPCR)，sybr green I，RT試劑，以上試劑均購自Western Biotechnology公司；DEPC處理水(DNase/RNase-free)購自美國Sigma公司；RNA提取劑(TRIzol)購自中國碧云天公司；實時熒光定量 PCR 儀購自加拿大Funglyn Biotech公司；電泳儀購自美國Bio-rad公司；凝膠成像儀購自美國Tianneng公司；GDS8000 凝膠掃描系統購自美國UVP公司。

1.2 動物分組及造模

1.2.1 實驗動物分組 50只清潔級雄性SD大鼠分籠飼養，維持飼養環境穩定，濕度50% 左右，溫度25 ℃左右，明暗周期12 h，自由飲水和進食，適應性喂養3周后稱重記錄。按隨機數字表法分為正常對照組(正常組)、正常創面對照組(正常對照組)、慢性難愈合創面組(難愈合組)、貝復濟處理慢性難愈合創面組(貝復濟組)、石香膏處理慢性難愈合創面組(石香膏組)5組，共設2時間點(分別為造模后7 d/14 d),每組每時間點5只共50只。

1.2.2 建立誘導糖尿病大鼠模型 造模前禁食18 h，可自由飲水；造模前先測量大鼠體質量并記錄，比較大鼠前后體質量差異變化。用采血針于尾靜脈處采血，血糖儀測定血糖，分別記錄各大鼠血糖值；然后以pH值為4.0，濃度為 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素(STZ)配制成1%溶液，將配置好的溶液以65 mg/kg的標準一次性腹腔注射于難愈合組、貝復濟組、石香膏組大鼠體內，72 h后用上述測血糖方法測量，若隨機血糖值>16.7 mmol/L，即為誘導糖尿病模型。若測得隨機血糖>33.3 mmol/L，按血糖升高程度，肌肉注射諾和靈R(1-4 U/d)控制血糖，以提高實驗數據準確性，減少誤差。正常對照組組大鼠僅注射濃度為0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液作為對照[9]。

1.2.3 建立慢性難愈合創面大鼠模型 注射1周后剃去正常對照組、難愈合組、貝復濟組、石香膏組大鼠背部毛發，給予硫化鋇再次脫毛，用鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，將腰椎正中偏上處定為造模區并標記一直徑約3 cm的圓形區域，術前備皮，在標準無菌操作下沿圓形區域剪去皮膚、皮下組織直至顯露肌筋膜，形成大鼠全層皮膚缺損開放性創面。

1.3 動物用藥

待大鼠創面充分止血后用藥，給藥劑量按《中藥藥理研究方法學》所提供的《實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算比率表》倍數折算，計算出人鼠等效劑量為11.61 g/kg。貝復濟組創面外用貝復濟約0.2 ml，石香膏組創面外敷石香膏厚度約2 mm，保證完全覆蓋創面，正常對照組、難愈合組、貝復濟組、石香膏組均以兩層無污染清潔紗布敷料覆蓋，膠布充分固定牢靠。從術前1 d起開始計算，連續4 d對各大鼠肌注青霉素(4000 U/只)防止感染。飼養方法同前。

1.4 標本采集

分別在創面造模后第7天、第14天給予鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，取正常對照組、難愈合組、貝復濟組、石香膏組大鼠背部創面肉芽組織標本。部分肉芽組織標本采用10%甲醛溶液固定，制成石蠟塊保存；部分置于-70 ℃冰箱中保存。

1.5 檢測

用切片機將石蠟塊中的組織切成5 μm厚的薄片，經烤片、脫蠟、復水后HE染色，光鏡下觀察大鼠背部創面生長情況和病理變化。

使用Trizol法提取大鼠背部創面肉芽組織標本中的RNA，用隨機引物將RNA進行逆轉錄反應，總反應體系20 μL，25℃10 min，42℃50 min，85℃5 min合成cDNA，然后設計特異性的引物和sybr green Ⅰ熒光染料進行熒光定量PCR檢測，總反應體積50 μL，條件設置94℃4 min，94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec循環35次，72 ℃時檢測信號。RAGE：上游：5′-GGGACTCTTCACGCTTCGG-3′，下游：5′-ACCTTCAGGCTCAACCAACAG-3′，目的片段長度：187 bp；NF-κBp65：上游：5′-,下游：5′-GGGTGCGTCTTAGTGGTATCTG-3′,目的片段長度：168 bp；eNOS：上游：5′-GCAACAAACCGAGGCAATC-3′，下游：5′-GGTCCAGCCATGTTGAATACAG-3′，目的片段長度：189 bp。β-actin作為內參，2-△CT法計算相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 創面大體形態觀察

圖1顯示，正常對照組(B1、B2)與難愈合組(C1、C2)在造模14 d后創面仍未完全修復，而貝復濟組(D1、D2)與石香膏組(E1、E2)在造模14 d后創面修復情況較好，且石香膏組比貝復濟組愈合情況更好。

注：B1.造模后7 d正常對照組；B2.造模后14 d正常對照組；C1.造模后7 d難愈合組；C2.造模后14 d難愈合組；D1.造模后7 d貝復濟組；D2.造模后14 d貝復濟組；E1.造模后7 d石香膏組；E2.造模后14 d石香膏組圖1 干預7/14 d后正常對照組、難愈合組、貝復濟組、石香膏組大鼠創面大體形態觀察比較

注：B1.造模后7 d正常對照組；B2.造模后14 d正常對照組；C1.造模后7 d難愈合組；C2.造模后14 d難愈合組；D1.造模后7 d貝復濟組；D2.造模后14 d貝復濟組；E1.造模后7 d石香膏組；E2.造模后14 d石香膏組圖2 干預7/14 d后正常對照組、難愈合組、貝復濟組、石香膏組大鼠創面組織HE染色光鏡比較(HE×400)

2.2 創面組織鏡下觀察

圖2顯示，正常對照組(B1、B2)與難愈合組(C1、C2)在造模14 d后鏡下仍可見大片未修復組織，而貝復濟組(D1、D2)與石香膏組(E1、E2)在造模14 d后創面組織修復情況較好，鏡下可見較多的纖維細胞和成纖維細胞，促進新生血管形成及創面修復，兩者比較石香膏組修復情況較好。

2.3 RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA表達情況

表1顯示，干預7 d后與正常對照組比較，難愈合組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量升高，eNOS mRNA相對表達量降低，石香膏組和貝復濟組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與難愈合組比較，貝復濟組和石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與貝復濟組比較，石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 干預7 d后各組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA相對表達量比較

注：與同時間點正常對照組比較：(1)P<0.01；與同時間點難愈合組比較：(2)P<0.01；與同時間點貝復濟組比較：(3)P<0.01

表1顯示，干預14 d后與正常對照組比較，難愈合組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量升高，eNOS mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.01)。石香膏組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與難愈合組比較，貝復濟組和石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與貝復濟組比較，石香膏組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

慢性難愈合潰瘍創面的中醫辨證屬于“癰疽”范疇。“癰疽”的中醫病機為各種原因導致局部氣血壅遏，脈絡不暢，終致肉腐血敗。《素問·生氣通天論》所云:“營氣不從，逆于肉理，乃生癰腫。”經過長期的實踐與探索，形成了“提膿祛腐，煨膿長肉”的創新性理論體系。前者依據“腐不去則新肉不生”的理論，使用丹類藥物，使瘡瘍內腐肉脫落，膿毒排出；后者則是指在瘡瘍祛腐排膿之后，運用斂瘡生肌、活血化瘀類藥物調節患處氣血，促進局部組織快速生長。中藥“石香膏”是由乳香、沒藥、赤石脂、梔子、煅龍骨、冰片、爐甘石等藥物調制而成。方中乳香、沒藥均能活血定痛，消腫生肌；赤石脂止血生肌，收濕斂瘡；梔子清熱利濕，涼血解毒；煅龍骨收斂固澀；冰片清熱解毒，去腐生肌；爐甘石收濕止癢斂瘡解毒。膏中溶劑為麻油和蜂蠟，不僅能保持創面的濕潤，還能避免藥物對皮膚的過度刺激，以充分促進創面肉芽的生長及上皮組織的再生。現代藥理學認為，乳香能通過抑制促炎癥反應細胞活素類的生成，減少基質金屬蛋白酶的分泌與活性進行抗炎、抗菌以及抗潰瘍[10]；沒藥、赤石脂能縮短凝血酶時間，抑制血小板聚集，使傷口具有良好的祛瘀、止血效果[11-12]；梔子具有抗氧化、抗細胞凋亡和促血管內皮細胞生長的功能[13]；煅龍骨中的鋅參與核酸及蛋白質代謝，維持細胞膜的正常生理功能和調節機體免疫功能，積極參與損傷的修復過程，有助于慢性難愈合傷口的愈合[14]；冰片具有消炎、鎮痛、抗菌的作用，特別是對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用[15]；爐甘石能促進成纖維細胞的增殖和遷移，加快毛細血管生長，促進血液循環，最終加快傷口愈合[16]。將這些藥物聯合使用，起到“提膿祛腐，煨膿長肉”的治療效果。貝復濟作為本次試驗的對照藥物，具有改善局部血液循環，促進創面修復的作用。

創面修復是一個包括凝血過程、組織增殖等多個階段的復雜過程。由于致傷因子的作用造成局部組織破壞缺損，局部組織通過再生、修復、重建等一系列過程對患處進行修補[17]。糖尿病患者因為長期處于高血糖狀態下，易生成AGEs(Advanced glycation end products，糖基化終末產物)，此物質為體內蛋白在非酶糖化和氧化反應下與還原糖結合形成的結構，對創面愈合有抑制作用[18]。由于AGEs在各種細胞中的積累，細胞結構和功能可能會隨著RAGE的參與而變化。RAGE是AGEs的受體，是細胞表面分子免疫球蛋白家族的成員，由多種細胞表達，可能介導炎癥體的激活和隨后炎癥介質的釋放，從而促進天然免疫反應的傳播[19-20]。當AGEs和RAGE結合后，觸發不同的信號傳導。NF-κB即為其產物之一，NF-κB是具有轉錄激活調節功能的一種轉錄因子，由p50和p65等亞基組成，其中p65亞基是NF-κB中分布最廣、作用最強的成員[21]。NF-κB的激活會促進多種基因的表達，調節免疫反應和炎癥反應，破壞組織修復細胞[22]。p65亞基的增加會促進RAGE抑制抗炎因子的同時增加促炎因子的活性，抑制組織修復。NF-κBp65的活化靶向激活許多基因表達，如TF、p21 RAS、細胞外信號調節激酶1/2(ERK 1/2)以及RAGE本身的表達。這些促氧化基因的激活可以促進NOS(Nitric oxidesynthase，一氧化氮合酶)在其他輔助因子的作用下，使NO(一氧化氮)分泌增加,可以促進血管修復再生，在調節血管穩態方面有重要作用。eNOS是NOS其中的一個同工酶，產生的NO可以調節如蛋白質的轉運、氧化還原等過程。皮膚創面組織主要表達的是eNOS，并由eNOS維持皮膚組織中NO代謝的平衡[23-24]。

本次研究通過建立實驗性慢性難愈合創面大鼠模型，觀察了中藥“石香膏”外敷對其創面RAGE、NF-κBp65、eNOS信號通路mRNA的表達情況。研究表明，與慢性難愈合創面組比較，石香膏處理慢性難愈合創面組與貝復濟處理慢性難愈合創面組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達量降低，eNOS mRNA相對表達量升高。其中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA降低程度在7 d、14 d時石香膏處理慢性難愈合創面組均優于貝復濟處理慢性難愈合創面組。而對于eNOS mRNA，在7 d時石香膏處理慢性難愈合創面組其表達量優于貝復濟組，在14 d時兩者未見明顯差異。綜上所述，石香膏對于難愈性創面的修復效果優于貝復濟。本次動物實驗研究初步闡明了中藥石香膏對于慢性難愈合創面具有修復作用，推測其作用機制之一為抑制RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA表達，減少細胞組織損害，從而促進eNOS mRNA的表達，增加NO分泌，有助于創面的血管新生和傷口愈合，為臨床中醫治療慢性難愈合創面開拓了新的思路與方法。