中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)及其在相關炎性疾病的研究進展①

曹維嘉 邵子瑋 段孟洮 高玲玲 張有成 徐小東

(蘭州大學第二醫院普通外科，蘭州 730000)

中性粒細胞作為人體免疫系統的重要防線，在機體免疫應答時發揮著極為關鍵的作用。機體受到病原體入侵時，中性粒細胞迅速聚集在損傷組織，通過吞噬和脫顆粒作用殺滅侵入的病原微生物。2004年Brinkmann等[1]首次發現，活化的中性粒細胞還可以通過釋放中性粒細胞胞外誘捕網(Neutrophil extracellular traps,NETs)來參與捕獲并殺滅病原菌。NETs組成成分復雜，多種參與炎癥反應的蛋白附著于其網狀結構[1-4]。近年來多項研究發現NETs的產生與多種炎性疾病的發生和進展密切相關。本文主要介紹了NETs的主要成分、作用、形成方式、檢測指標以及其在相關炎性疾病中的研究進展。

1 NETs的主要成分及作用

NETs是活化的中性粒細通過不同的方式向細胞外釋放的高濃度網狀DNA復合物，除了去聚化的染色質DNA外，其網狀結構上主要黏附著瓜氨酸化組蛋白(CitH3)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、髄過氧化物酶(MPO)、長正五聚蛋白(PTX-3)、抗菌肽LL-37等30多種蛋白和酶。研究發現脫氧核糖核酸酶(DNase)能夠直接破壞染色質DNA迅速降解NETs，證明去聚化的胞外染色質DNA是NETs最為重要的成分[1]。

研究表明，NETs除了殺滅病原菌外，還可以導致組織損傷并參與多種疾病的發展。NETs的這些生理作用與其組成成分密切相關。具有細胞毒性的細胞外組蛋白作為NETs的主要成分，能夠破壞內皮細胞、水解蛋白質參與組織損傷。精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)介導組蛋白的瓜氨酸化更是NETs形成的關鍵步驟[2]。NE和PR3等絲氨酸蛋白酶通過切割毒力因子或裂解惰性前體蛋白抑制微生物的生長。有研究發現NE還可以抑制組織因子(TFPI)，促進血管內纖維蛋白屏障的生成[3-5]。具有氧化活性的MPO不僅可以與活性氧(ROS)相互作用刺激NETs生成，同時還可以通過產生次氯酸殺滅病原菌。最近，有研究人員發現NETs上的P因子和補體C3可以將其捕獲的病原微生物呈遞給其他具有殺菌作用的細胞，從而共同限制機體炎癥發展[6]。當體內NETs生成過量時，長正五聚蛋白(PTX-3)能夠減輕組蛋白導致的損傷，調控體內NETs含量[7]。鑲嵌于NETs的分泌性蛋白酶抑制因子(SLPI)亦能夠調節NETs介導的組織損傷。此外，有研究發現SLPI作用于樹突狀細胞而誘導產生的Ⅰ型干擾素(IFN1)參與了系統性紅斑狼瘡(SLE)和牛皮癬等疾病的發病[5]。

2 NETs的形成方式

中性粒細胞形成NETs的方式被命名為 NETosis。研究證實，不同的刺激物作用于中性粒細胞后NETs的形成方式有所不同。

(1)研究發現中性粒細胞受到佛波酯(PMA)或IL-8等物質刺激后，在NADPH酶生成的活性氧(ROS)和鈣離子作用下，PAD4介導組蛋白瓜氨酸化導致染色質的去聚化[8]。同時，ROS作為第二信使作用于MPO協同NE和LL-37易位至細胞核，導致核解聚和核膜破裂。隨后胞質中具有殺滅病原微生物功能的各級顆粒和核染色質的融合物被排出到細胞外構成NETs的基本結構，這一過程長達1～4 h[9]。區別于既往的壞死和凋亡，NETs的形成伴隨著中性粒細胞死亡的方式被稱為Suicidal NETOsis。Raf-MEK-ERK通路和ROS的激活在其形成過程中扮演了關鍵角色[10]。

(2)Yipp等[11]在2012年通過活體顯影可視技術發現，金黃色葡萄菌在急性感染期能夠更為迅速(5～60 min)地刺激NETs產生。不同于Suicidal NETosis，中性粒細胞細胞膜上的TOLL樣受體或C3補體被金葡菌或TRL-4活化血小板等物質識別后，核DNA隨即以出芽的方式被包裹成囊泡釋放。同時，不同的胞質顆粒則聚集在囊泡周圍被一同排出胞外，此時胞內核膜保持完整，活化的中性粒細胞并不死亡且仍然保持著吞噬和趨化作用。NETs的這種形成方式被命名為Vital NETosis，其形成過程不依賴于Raf-MEK-ERK通路和ROS[10,12]。最近有研究表明血小板中活化的糖蛋白作用于中性粒細胞上的CD18黏附分子后，可以分別通過激活ERK、PI3k和SRC酶刺激PMN發生vital NETosis[13]。

(3)Yousefi等[14]發現在脂多糖(LPS)和C5a刺激后，中性粒細胞內的線粒體DNA在ROS作用下可以產生NETs，這一現象發生在更短的時間(15 min)內。NETs的形成過程中同樣不伴隨中性粒細胞的死亡，其調控機制尚不清楚。

3 NETs的檢測指標

由于結構的復雜性，NETs尚無統一的檢測指標和方法，目前主要通過檢測其特異成分的表達以確定存在。由中性粒細胞產生的游離胞外DNA(Cell-free DNA)作為NETs的主要成分，經常被用來檢測NETs的存在。該檢測方法的局限性在于不能與巨噬細胞產生的少量Cell-free DNA進行區別[15]。PAD4介導的citH3被認為是NETs形成的標志物，因此被廣泛運用于檢測NETs的表達。需要注意的是，有報道稱部分NETs的形成可能并不依賴于PAD4[16]。最新的研究表明，citH3還可以作為部分腫瘤早期診斷和判定預后的潛在指標[17]。在底物酶和不同抗體作用下標記的DNA和胞外蛋白DNA-NE、DNA-MPO共定位復合物由于具有高度特異性，因而在NETs的檢測中最具有代表性[15]。

4 NETs與炎性疾病

4.1NETs與痛風關節炎 痛風關節炎是一種由過度飽和的針狀尿酸鹽結晶(MSU)沉積在關節引發的自限性急性炎癥，MSU晶體刺激中性粒細胞聚集和活化是引發痛風急性發作的關鍵。MSU晶體與NETs的相互作用進一步揭示了痛風關節炎的發病機理。研究證實痛風患者滑膜液中充滿白介素IL-1β、IL-18、MSU晶體以及中性粒細胞[18]。Mitroulis等[19]在痛風滑膜液中發現了染色的dsDNA和MPO等NETs組分。滑膜液中的MSU晶體可以通過刺激中性粒細胞發生NETosis和炎癥反應。同時，巨噬細胞NLPR3 炎性體分泌的IL-1β可以通過增強MSU晶體作用，刺激中性粒細胞產生更多的NETs。過量的NETs與伴隨其釋放的有害顆粒蛋白可能共同加劇了炎癥癥狀[20]。最近有研究證實NETs參與了痛風關節炎的緩解。隨著NETs的大量積累，高濃度的NETs黏附形成特殊聚合網狀結構aggregated NETs(aggNETs)。Schauer等[21]研究表明aggNETs能迅速捕捉促炎因子和趨化因子，通過降解促炎介質的水平和抑制中性粒細胞的聚集限制急性期炎癥加重。aggNETs上大量暴露的絲氨酸蛋白酶參與了這一過程。另外，急性炎癥末期白色的aggNETs還可以覆蓋在MSU結晶表面將其與炎癥介質隔離，促使其形成成熟的痛風石，從而完全停止對機體的急性損傷。

MUS誘導NETs生成的分子及其調節機制目前尚不完全清楚。NADPH氧化酶缺乏的大鼠中性粒細胞被MSU刺激后NETs和aggNETs不能形成，提示NADPH氧化酶參與了這一過程[21]。Desai等[22]通過RIPK1、RIPK3、MLKL的抑制劑分別阻止MUS刺激NETs生成后，ROS的產生并未受到影響，提示NETs的形成可能涉及ROS下游的RIPK1-RIPK3-MLKL信號凋亡途徑。最近，Arai等[23]發現可溶性尿酸獨立于NADPH氧化酶刺激生成了NETs，表明痛風中NETs的生成機制可能是復雜多樣的。嘌呤P2Y6受體也被證實參與了痛風發作時NETs的形成。Sil等[24]通過實時成像技術發現，P2Y6特殊抑制劑MRS2578能夠減少PMN的聚集，阻止aggNETs的生成，其機制可能與抑制ROS和促炎因子IL-8釋放有關。最新的研究顯示，吞噬細胞可以通過吞噬微小的尿酸鹽聚合體SMA，阻止循環中MSU結晶及NETs的生成[25]。

4.2NETs與胰腺炎 胰腺炎是由多種病因引起胰酶大量分泌而導致的胰腺自身消化、水腫、出血及壞死的炎性疾病，目前尚無特效的治療手段。炎癥介質和胰蛋白酶釋放發生紊亂被認為是炎癥發生和加重的關鍵[26]。Merza等[27]的體內體外研究表明，NETs參與了胰腺炎的病理生理過程。在建立的重癥急性胰腺炎(SAP)模型大鼠胰腺內，研究人員通過免疫熒光技術觀察到了大量NETs的產生，而體內循環中cfDNA濃度和CitH3的表達增加證實了NETs的產生。通過在模型大鼠體內注射脫氧核糖核酸酶(DNase)預處理中性粒細胞降解NETs，減少了腺泡細胞以及胰腺組織的損傷。在此之前，高表達的組蛋白已經被證實參與了胰腺炎時胰腺組織損傷[28]。隨著NETs的降解，DNase酶還降低了包括CXCL2、IL-6、HMGB1在內的多種炎癥介質和蛋白酶的濃度。體外實驗發現，NETs還能夠直接作用腺泡細胞激活胰蛋白酶和STAT3信號通路，其機制可能與NETs產生時NADPH酶大量形成有關[27,28]。Moritz等[29]在IL-17基因過度表達誘發的胰腺炎小鼠體內發現了大量PAD4介導的CitH3和NE。PAD4基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，PAD4基因缺乏小鼠基本不能被IL-17誘導發展為胰腺炎。這可能與PAD4基因缺乏導致的組蛋白不能瓜氨酸化相關。IL-17等炎癥因子誘導中性粒細胞向胰腺胰管聚集，而導管中的堿性環境和大量的Ca離子是PAD4表達上調的重要條件。進一步的研究發現，聚集在胰腺導管內的嗜中性粒細胞受到胰液中的碳酸鹽的刺激后，通過釋放胞外染色質纏繞的aggNETs亦可以阻礙胰液分泌激活胰蛋白酶。這些現象提示NETs可能參與了胰腺炎的發病機制。因此調控體內NETs的生成可能成為治療胰腺炎的潛在手段。

4.3NETs與其他炎性疾病 ①2型糖尿病患者往往涉及中性粒細胞計數增加和吞噬功能障礙等慢性炎癥的表現，高血糖患者體內炎癥細胞產生的氧化應激環境和炎癥因子有利于NETosis 的發生。研究證實糖尿病模型大鼠的中性粒細胞被PMA刺激后更容易出現NETs，其體內PAD4的表達相較于正常組上升4倍[30]。此外，相較于健康人群，糖尿病患者體內dsDNA和NE等NETs的內容物含量明顯增加，其增加程度和糖化血紅素(HbA1c)以及IL-6濃度呈正相關[31]。②糖尿病視網膜疾病和視網膜靜脈阻塞等眼部疾病會導致視力下降甚至喪失，視網膜細胞分泌的炎癥因子IL-8和TNF-α被證實參與眼部炎癥發病環節[32]。研究人員在視網膜脫落患者的玻璃體中發現了CitH3。NETs的細胞毒性作用歸咎于組蛋白成分，其可以防止胞外DNA的降解和損傷微血管[33]。Barliya等[32]在向大鼠眼部注射白介素IL-8和TNF-α 24 h后，首次在大鼠眼部觀察到CitH3。而大鼠眼部注射DNAse 酶后，染色的CitH3發生降解，NETs隨即消失。隨后研究人員在增生型糖尿病視網膜病變的患者眼部同樣發現了NE-MPO和CitH3-MPO等NETs的主要成分，由此證實NETs可能參與了眼部疾病的炎癥反應[32]。

5 結語

自發現NETs的十余年來，有關NETs的研究成為炎性疾病研究的熱點。近年來國內外的研究表明，NETs除了能消滅病原微生物外，還從多個方面參與并影響了炎性疾病的病理生理過程。雖然NETs在這些疾病中的具體作用機制及信號通路的研究尚處于起步階段，但已有的研究結果提示我們，對NETs在炎性疾病中的作用進一步研究，完善NETs的相關調控機制，可能會為今后炎性疾病的治療方案和特異性靶點藥物的開發提供新的發展思路。