靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮對大鼠甲醛炎性痛的影響及機制探討*

彭志鋒，馬國英，楊靖輝

（山西大同大學醫(yī)學院 生理教研室，山西 大同 037009）

奈福泮是一種非阿片和甾體類鎮(zhèn)痛藥物。奈福泮鎮(zhèn)痛作用機制目前尚不明確，但以往研究提示，奈福泮可能通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[1]。最近的一項研究提示，奈福泮通過調(diào)節(jié)脊髓去甲腎上腺素水平在大鼠炎性痛模型中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[2]。此外，奈福泮鎮(zhèn)痛機制也可能涉及多巴胺的傳遞[3]。因為多巴胺耗竭可減小奈福泮在大鼠熱板試驗中的的鎮(zhèn)痛作用[4]。相反，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響奈福泮在小鼠扭體試驗中的鎮(zhèn)痛作用，但可抑制奈福泮在甲醛試驗的鎮(zhèn)痛作用[5]。目前奈福泮通過抑制多巴胺再攝取發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用未見相關(guān)報道。本研究目的是評估多巴胺能神經(jīng)傳遞在奈福泮鎮(zhèn)痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

45只雄性SD大鼠（225～250 g）購于山西醫(yī)科大學動物中心。室內(nèi)溫度保持在22～23℃左右，濕度在50%左右。明暗周期12 h，自由飲水和進食。按靜脈注射方式將大鼠分成對照組、鹽酸奈福泮組（1或3 mg/kg）及鹽酸奈福泮（3 mg/kg）+舒必利（3 mg/kg）組（奈福泮+舒必利組），對照組尾靜脈注射等量生理鹽水，每組5只大鼠。按鞘內(nèi)注射方式將大鼠分成對照組、鹽酸奈福泮組（3、10或30 μg）及鹽酸奈福泮（30 μg）+舒必利（100 μg）組，注射溶液均為10 μl，對照組鞘內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2 實驗儀器和試劑

鹽酸奈福泮（重慶西南藥業(yè)股份有限公司），舒必利（美國Sigma公司），甲醛（美國Sigma公司），立體定位儀（北京拜安吉科技有限公司），液相色譜儀器（南京科捷分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)制大鼠炎性痛模型 限制大鼠后，用注射器在各組大鼠后肢足底單次注射5%甲醛溶液50 μl。

1.3.2 大鼠鞘內(nèi)插管 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（0.06 g/kg），頸后部剪毛、消毒，在兩耳連線中央做縱向切口，暴露枕骨寰枕膜，然后從此處插入PE-10管，深6 cm，最終達到蛛網(wǎng)膜下池，固定PE-10管。甲醛注射前10 min通過靜脈或鞘內(nèi)注射不同劑量鹽酸奈福泮；舒必利組在鹽酸奈福泮靜脈或鞘內(nèi)注射前10 min注射舒必利。

1.4 大鼠痛行為檢測

大鼠注射甲醛后表現(xiàn)出特有的退縮反應(yīng)，分為兩期，其中I期是急性傷害性反應(yīng)（0～9 min），直接刺激外周傷害性感受器引起；接著是Ⅱ期（10～60 min），由脊髓背角及外周神經(jīng)元敏感化所致。單位時間內(nèi)大鼠注射足退縮反應(yīng)次數(shù)作為觀察指標。給予大鼠甲醛后即開始計時，每間隔5 min觀察1次，持續(xù)60 min。

1.5 微透析分析

首先麻醉大鼠，右股靜脈插管注射乳酸林格液（1 ml/h），胸腰椎椎板切除術(shù)后暴露脊髓L3～L5段，大鼠固定于立體定位儀上。按照以往文獻描述，打開硬膜后，微透析探針推進到脊髓背角淺層，通過微量注射泵灌注Ringer平衡鹽溶液（1 μl/min），120 min持續(xù)灌注后，連續(xù)采集2個樣本，通過高效液相層析法檢測透析液中多巴胺濃度[6]。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）或百分數(shù)表示。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析。多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，然后進行Bonferroni事后檢驗，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 靜脈及鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮對大鼠退縮反應(yīng)的影響

對照組與靜脈注射不同劑量鹽酸奈福泮組大鼠的退縮反應(yīng)次數(shù)，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。結(jié)果：①不同時間點大鼠退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=13.738，P=0.007）；②對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=10.482，P=0.012），對照組退縮反應(yīng)次數(shù)高于不同劑量鹽酸奈福泮組；③對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)變化趨勢有差異（F=9.061，P=0.025）。與對照組比較，靜脈注射鹽酸奈福泮（3 mg/kg）可使甲醛誘導(dǎo)的I期退縮反應(yīng)次數(shù)降低60%，而Ⅱ期退縮反應(yīng)次數(shù)無變化（見圖1）。對照組與不同劑量鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮組大鼠的退縮反應(yīng)次數(shù)，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。結(jié)果：①不同時間點大鼠退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=15.846，P=0.006）；②對照組與不同劑量鹽酸奈福泮有差異（F=14.085，P=0.008），對照組退縮反應(yīng)次數(shù)高于不同劑量鹽酸奈福泮組；③對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)變化趨勢有差異（F=12.972，P=0.012）。鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可使甲醛誘導(dǎo)的2個階段退縮反應(yīng)降低。其中30 μg鹽酸奈福泮使I期和Ⅱ期退縮反應(yīng)次數(shù)降低49%和44%（見圖2）。

2.2 微透析研究情況

圖1 靜脈注射奈福泮對甲醛誘導(dǎo)的大鼠退縮反應(yīng)的影響

圖2 鞘內(nèi)注射奈福泮對甲醛誘導(dǎo)的大鼠退縮反應(yīng)的影響

靜脈注射鹽酸奈福泮后，對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組的多巴胺水平比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點多巴胺水平無差異（F=3.731，P=0.064）；②各組的多巴胺水平無差異（F=3.061，P=0.072）；③各組多巴胺水平變化趨勢無差（F=2.843，P=0.083）。鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮后，對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組不同時間點的多巴胺水平比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。結(jié)果：①不同時間點的多巴胺水平有差異（F=13.904，P=0.008）；②對照組與不同劑量鹽酸奈福泮組在甲醛注射后不同時間點多巴胺水平有差異（F=11.647，P=0.011），對照組多巴胺水平低于鹽酸奈福泮組；③對照組和鹽酸奈福泮組多巴胺水平變化趨勢有差異（F=15.529，P=0.006）。見圖 3。

2.3 舒必利對鹽酸奈福泮鎮(zhèn)痛作用的影響

靜脈預(yù)處理舒必利，不影響鹽酸奈福泮對甲醛模型的鎮(zhèn)痛作用。同樣，鞘內(nèi)注射舒必利，也不影響鹽酸奈福泮對甲醛模型的鎮(zhèn)痛作用。見圖4。

圖3 靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（30 μg）注射鹽酸奈福泮后脊髓背角細胞外多巴胺水平

圖4 靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（100 μg）預(yù)注射舒必利對靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（30 μg）注射奈福泮鎮(zhèn)痛作用的影響

3 討論

本研究顯示，靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可減少甲醛引起的疼痛行為。微透析檢測發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)而不是靜脈注射鹽酸奈福泮增加脊髓背角細胞外多巴胺水平。然而，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。本結(jié)果表明，奈福泮鎮(zhèn)痛機制可能不涉及脊髓水平多巴胺能傳遞，雖然奈福泮進入脊髓后可抑制多巴胺再攝取。

奈福泮一直被認為是單胺類遞質(zhì)（包括多巴胺）再攝取的抑制劑[2]。然而，本研究首次檢測在體大鼠脊髓背角細胞外多巴胺水平的變化。由于奈福泮容易通過血腦屏障進入大腦內(nèi)，筆者假定靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮均會增加中樞中多巴胺水平。然而，在本研究中，只有鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可使多巴胺水平升高，而靜脈給藥不能增加多巴胺水平。在預(yù)實驗中，靜脈注射鹽酸奈福泮（10 mg/kg）或更高劑量降低甲醛誘導(dǎo)的退縮行為，同時微透析研究中多巴胺水平也增高，但經(jīng)常會出現(xiàn)不良反應(yīng)，如呼吸抑制和（或）死亡等。因此，在目前的研究中，靜脈注射鹽酸奈福泮劑量是3 mg/kg，可能不能完全抑制脊髓多巴胺再攝取。總之，靜脈注射奈福泮不能增加脊髓細胞外多巴胺水平可能由于其注射劑量。另一方面，多巴胺D2受體拮抗劑未減弱鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，雖然鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可增加脊髓背角細胞外多巴胺水平。因為脊髓多巴胺能系統(tǒng)已被證明通過激活D2受體調(diào)節(jié)傷害性信息的傳遞[7]。然而，眾多報道提示，腦而不是脊髓通路通過多巴胺能神經(jīng)傳遞參與痛覺調(diào)節(jié)[8-9]。

鞘內(nèi)注射大劑量D2-受體激動劑僅表現(xiàn)短暫的鎮(zhèn)痛作用，而全身注射低劑量該藥物產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)超過48 h[9]?？偟膩碚f，腦而不是脊髓通路在多巴胺鎮(zhèn)痛作用中發(fā)揮重要作用。本研究中鞘內(nèi)注射10 μg鹽酸奈福泮量可能僅擴散于脊髓水平[10]。因此，鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮不能激活脊髓以上多巴胺通路，從而影響疼痛。因此，筆者推測多巴胺能調(diào)節(jié)可能不參與鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛機制。目前多巴胺能系統(tǒng)是否參與奈福泮鎮(zhèn)痛機制仍存在爭議。有研究指出，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響奈福泮在扭體試驗中的鎮(zhèn)痛作用[11]。這與本研究的結(jié)果一致。在另一項研究中，3 mg/kg而不是10 mg/kg舒必利阻斷奈福泮在小鼠甲醛模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果差異可能是由于研究方法不一樣所致，比如藥物注射途徑、給藥劑量及疼痛類型等，從而通過腦和（或）脊髓通路發(fā)揮作用。

總之，本研究表明靜脈和鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮均可有效緩解福爾馬林誘導(dǎo)的大鼠炎性疼，然而奈福泮鎮(zhèn)痛機制可能不涉及脊髓水平多巴胺能傳遞。