糙皮側(cè)耳藍光受體基因Po.WC-1的克隆及分析

孫憲凱 張夢珂 文 晴 申進文 戚元成

（河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002）

光作為一種重要的環(huán)境因子，對生物的發(fā)育至關(guān)重要。除了作用于植物光合作用，還影響真菌的生長發(fā)育、晝夜節(jié)律、次級代謝的產(chǎn)生等過程。為了適應環(huán)境的變化，真菌形成了完整的光調(diào)節(jié)機制，可以通過光受體來感受光質(zhì)、光強和光照周期，以便更好地生存。眾所周知白光是由許多單色光組成的復合光，研究證實在真菌中藍光是影響其生長發(fā)育的重要因素[1-3]。藍光信號主要是由white collar complex（WCC）進行響應的，且 WCC 是由white collar 1（WC-1）和 white collar 2（WC-2）蛋白組成的[4-5]。WC-1包含有三個PAS（Per-Arnt-Sim）結(jié)構(gòu)域，其中WC-1靠近N端的PAS結(jié)構(gòu)域又叫作LOV（Light，Oxygen，Voltage）結(jié)構(gòu)域，它的蛋白上有一個黃色發(fā)色團FAD（flavin adenine dinucleotide），正因為如此，WCC才能夠捕捉光信號[6]。光誘導WCC的表達是瞬時的，在持續(xù)光照下，WC-1蛋白被磷酸化，導致WCC的失活和WC-1的降解。光是通過新合成的WC-1調(diào)節(jié)真菌生長發(fā)育過程[7]。粗糙脈孢菌的基因組也包含VIVID基因[8]，VIVID基因是WC-1和WC-2的同源基因，并且VIVID蛋白已被證實參與到光激活基因過程中。目前已經(jīng)在香菇[10]、裂褶菌[11]、灰蓋鬼傘[12]、粗糙脈孢菌[13]、新型隱球菌[14]、里氏木霉[15]、蛹蟲草[22]等多種真菌中均發(fā)現(xiàn)了藍光受體WC-1的存在。

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）是世界上栽培范圍最廣的食用菌之一，而對于其光受體的研究比較少。1987年，Richartz&Maclellan[9]對平菇使用的菌絲聚集光譜的方法，發(fā)現(xiàn)藍光對單核和雙核的菌絲生長速率都具有抑制作用，證實在370 nm和430～460 nm處存在兩個極值，具有藍光受體的特性。說明糙皮側(cè)耳可能在藍色光譜區(qū)域存在藍光受體，并且發(fā)現(xiàn)高強度的光抑制菌絲的生長，適量的光可以促進糙皮側(cè)耳菌絲從營養(yǎng)生長到原基形成、子實體發(fā)育。筆者通過同源比對的方法獲得糙皮側(cè)耳藍光受體基因WC-1，命名為Po.WC-1，克隆得到了全長cDNA序列，并對此基因進行了初步的功能分析預測及轉(zhuǎn)錄水平分析，為對該基因功能的深入分析及其下游基因的研究提供參考，為糙皮側(cè)耳光形態(tài)建成的研究提供分子水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

糙皮側(cè)耳新831菌株為河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院應用真菌研究室保藏；pEASY-blunt E1 expression kit、pEASY-blunt cloning kit、TransStart FastPfu DNA polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；RNA trizol plus購自大連寶生物公司；OMEGA DNA凝膠回收試劑盒、Thermo Fisher反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自河南比根生物技術(shù)有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京挪威贊生物技術(shù)有限公司。

1.2 糙皮側(cè)耳藍光受體基因Po.WC-1基因的克隆

糙皮側(cè)耳新831接種、菌絲培養(yǎng)及出菇管理參照戚元成等（2016a）的方法。使用TRIzol法提取菌絲期、原基期及子實體總RNA。采用CTAB法提取糙皮側(cè)耳基因組DNA。真菌藍光受體的PAS結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，利用裂褶菌Sc.WC-1（XM_003028928.1）的 PAS 結(jié)構(gòu)域在 JGI（https：∕∕genome.jgi.doe.gov∕）糙皮側(cè)耳PC9 V1.0、PC15 V2.0數(shù)據(jù)庫菌株的轉(zhuǎn)錄組進行比對，得到了相似度比較高的糙皮側(cè)耳序列PC15_2|scaffold 02 1518347-1518375。以PC15_2|scaffold 02 1518347-1518375為模板，利用Primer 5.0設計引物，試驗所有引物由北京六合華大基因研究中心合成（表1）。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA的第一條鏈。分別以糙皮側(cè)耳cDNA和gDNA為模板，反應體系為：Template 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、2.5 mmol∕L dNTPs 4 μL、TransStart FastPfu DNA polymerase 1 μL、ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為：98℃ 預變性 1 min，98℃ 變性 20 s，53℃ 退火20 s，72℃ 延伸 60 s，30 個循環(huán)，72℃ 終延伸 3 min（CDS）∕5 min（gDNA）。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化擴增產(chǎn)物，將回收后的PCR產(chǎn)物與pEASY-blunt cloning vector進行連接，熱激發(fā)轉(zhuǎn)化進入E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)過氨芐青霉素（100 μg∕mL）抗性篩選、PCR驗證后提取質(zhì)粒，送往北京六合華大基因研究中心測序。

表1 試驗所需引物

1.3 糙皮側(cè)耳藍光受體基因Po.WC-1基因的生物信息學分析

在NCBI網(wǎng)站使用BLAST工具（https：∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi）對糙皮側(cè)耳Po.WC-1的測序結(jié)果與JGI上公布P.ostreatusPC15菌株的基因序列進行比對分析，并通過ORF finder（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕orffinder∕）對其 ORF進行分析。從 NCBI數(shù)據(jù)庫中下載其他真菌中已經(jīng)報道過的藍光受體的氨基酸序列，在 EMBL-EBI網(wǎng)站上（https：∕∕www.ebi.ac.uk∕Tools∕msa∕clustalo∕）進行多序列比對。在Gene Structure Display 網(wǎng)站上（http：∕∕gsds.cbi.pku.edu.cn∕index.php）對核苷酸結(jié)構(gòu)進行分析。在SMART 網(wǎng) 站 上（http：∕∕smart.embl-heidelberg.de ∕smart∕set_mode.cgi?NORMAL=1）預測氨基酸結(jié)構(gòu)。利用在線網(wǎng)站 ExPASy（http：∕∕web.expasy.org∕protparam∕）對目的蛋白的等電點以及分子量進行預測。利用MEGA7軟件的鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 糙皮側(cè)耳Po.WC-1原核表達

將Po.WC-1連接到pEASY-blunt E1 expression載體上，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，經(jīng)過氨青霉素（100 μg∕mL）抗性篩選、PCR驗證后提取質(zhì)粒，測序驗證成功后將重組質(zhì)粒和E1空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌命名為E1-WC1。分別將含有重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的E.coliBL21菌株接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r∕min振蕩培養(yǎng)，當OD600達到0.5后，向LB液體培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為 0.1 mmol∕L 和 0.3 mmol∕L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集菌體進行超聲破碎，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。

1.5 糙皮側(cè)耳Po.WC-1菌絲期不同光照時間表達量分析

首先設置了100 lx、200 lx、300 lx、400 lx、500 lx、600 lx不同的六個藍光單色光光照強度，發(fā)現(xiàn)在300 lx下藍光已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的抑制現(xiàn)象（圖1），所以之后選取300 lx作為光照條件。將糙皮側(cè)耳新831打孔接種于直徑9 cm的SEM（1.5%麥芽浸膏，2%瓊脂）上，25℃完全黑暗條件下進行培養(yǎng)。然后將平板置于300 lx藍光或白光下，進行光照刺激0 min、15 min、30 min、45 min、60 min，每板三個重復。Trizol法提取不同時間總RNA，取1 μg總RNA樣品，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA的第一條鏈，選取糙皮側(cè)耳actin作為內(nèi)參基因，按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明，實時熒光定量分析糙皮側(cè)耳Po.WC-1在不同光照時間刺激下與完全黑暗條件下的差異表達。qRT-PCR反應體系為：10 μL SYBR Green Master Mix，上下游引物各 0.4 μL（10 μmol∕L），1 μL cDNA，7.2 μL ddH2O。循環(huán)參數(shù)設定為：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，60℃ 35 s，共40個循環(huán)，3次重復。反應在applied 7500實時熒光定量PCR儀上進行，利用2-ΔΔCT的方法計算目的基因相對表達量[11]。

圖1 不同藍光光照強度下糙皮側(cè)耳新831的生長情況

2 結(jié)果與分析

2.1 糙皮側(cè)耳Po.WC-1基因的克隆及生物信息學分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測以gDNA和cDNA為模板擴增的Po.WC-1序列，分別得到一條大小約為2300 bp和2000 bp（圖2）的特異條帶，測序結(jié)果顯示片段長度分別為2356 bp和1956 bp（KY348758），與糙皮側(cè)PleosPC15_2|1035381的gDNA序列及CDS序列一致性都是100%，對核苷酸結(jié)構(gòu)進行分析表明其基因組中不含有內(nèi)含子，并且具有完整的ORF。通過蛋白一級結(jié)構(gòu)預測表明Po.WC-1基因編碼651個氨基酸，蛋白分子量大小為71.74 kDa，等電點為6.38。通過SMAART網(wǎng)站對該蛋白進行結(jié)構(gòu)分析表明它具有三個保守的PAS結(jié)構(gòu)域和一個ZnF結(jié)構(gòu)域（圖4），在PAS A結(jié)構(gòu)域包含9個FMN相互作用的氨基酸殘基位點[20]和4個行使光功能必需的氨基酸殘基[21]（圖3），且在C端有一個谷氨酰胺富集區(qū)域。將糙皮側(cè)耳Po.WC-1（KY348758）與香菇Le.PHRA（AB279630.1）、裂 褶 菌 Sc.WC-1（XM_003028928.1）、灰蓋鬼傘 Cc.Dst1（AB195817.1）、粗糙脈孢菌Nc.WC-1（X94300.2）、新型隱球菌Cn.WC-1（AY660969.1）、里氏木霉 Blr1（AY628431.1）等種六種真菌的藍光受體WC-1進行比較（圖3）。如圖4所示，在這幾種真菌中它們的藍光受體WC-1蛋白都包含2～3個PAS域，并且PAS結(jié)構(gòu)域也具有較高的同源性，其中糙皮側(cè)耳與香菇、裂褶菌、灰蓋鬼傘對應的PAS結(jié)構(gòu)域相似度甚至達到了61%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）及相似性比對分析表明糙皮側(cè)耳Po.WC-1（KY348758）與香菇、裂褶菌、灰蓋鬼傘具有較近的親緣關(guān)系，這也跟它們都是同屬于擔子菌有關(guān)。

圖2 Po.WC-1基因gDNA及全長cDNA的PCR擴增圖譜

圖3 糙皮側(cè)耳Po.WC-1和其他真菌的藍光受體基因在PAS A、PAS B、PAS C結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果

圖4 Po.WC-1與有代表性的真菌光受體家族中的Le.PHRA、Sc.WC-1、Cc.Dst1、Nc.WC-1、Cn.WC-1比對的概要圖

圖5 根據(jù)Po.WC-1編碼的氨基酸序列比較構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 糙皮側(cè)耳Po.WC-1基因的原核表達分析

將純化后的Po.WC-1片段連接至pEASY-blunt E1原核表達載體上，測序驗證成功后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21菌株中，在37℃分別加入0 mmol∕L、0.1 mmol∕L、0.3 mmol∕L IPTG的條件下對重組質(zhì)粒進行誘導，收集菌體并進行破碎，分別將上清和沉淀進行SDSPAGE分析。結(jié)果表明Po.WC-1編碼的蛋白被成功誘導，主要是以包涵體的形式存在（圖5），蛋白分子量是72 kDa，符合預期分子量大小。由此證實筆者成功獲得了完整的Po.WC-1基因的ORF序列。

圖6 大腸桿菌異源表達糙皮側(cè)耳藍光受體Po.WC-1 SDS-PAGE圖譜（破碎后沉淀）

2.3 糙皮側(cè)耳Po.WC-1不同光照時間的差異表達

實時熒光定量PCR結(jié)果分析表明，糙皮側(cè)耳Po.WC-1（圖7）在300 lx藍光或300 lx白光下光照0 min、15 min、30 min、45 min、60 min表達量均明顯上調(diào)，且在15 min后Po.WC-1基因在藍光光照下表達量是白光光照下約2倍。但是，無論是在白光還是在藍光下，經(jīng)過15 min短時間的照射后Po.WC-1的表達量都到了峰值，隨Po.WC-1表達量逐漸降低到達相對穩(wěn)定的狀態(tài)，與蛹蟲草中報道的一致[22]。由此說明Po.WC-1基因可以響應光照刺激調(diào)節(jié)糙皮側(cè)耳的生長發(fā)育。

圖7 不同光照時間糙皮側(cè)耳Po.WC-1的差異表達

3 小結(jié)與討論

光作為一種重要的環(huán)境因子，影響植物和真菌的生長發(fā)育，而光受體作為轉(zhuǎn)錄因子，在光信號通路中發(fā)揮了重要的作用，其中，藍光受體在大多數(shù)真菌中起到主要的調(diào)節(jié)作用。真菌的光生物學已經(jīng)在模式菌株粗糙脈孢菌中進行了深入的研究[13]，通過多個實驗室對藍光受體WC-1和VIVID的研究，已經(jīng)證實它們參與調(diào)節(jié)粗糙脈孢菌的晝夜節(jié)律和光適應機制。近年來，有關(guān)真菌藍光受體的研究逐漸增多，尤其是在擔子菌香菇[10]和裂褶菌[11]中已經(jīng)進行了較為深入的研究，在香菇成熟的子實體中菌蓋、菌褶、菌柄中藍光受體基因PHRA的表達量也是不同的，在裂褶菌中敲除藍光受體基因WC-1即使在有光的條件下也不能形成原基和子實體，并且WC-1的缺失將影響下游基因的轉(zhuǎn)錄。

目前，在真菌中關(guān)于糙皮側(cè)耳藍光受體的研究比較少。本研究在糙皮側(cè)耳中首次得到了藍光受體Po.WC-1基因，SMART網(wǎng)站分析表明Po.WC-1包含真菌藍光受體保守的PAS A、PAS B、PAS C結(jié)構(gòu)域和ZnF結(jié)構(gòu)域，是香菇、裂褶菌等的同源序列。原核表達的結(jié)果表明成功得到了糙皮側(cè)耳藍光受體Po.WC-1完整的開放閱讀框。這些結(jié)果表明成功克隆到了糙皮側(cè)耳藍光受體基因。

采用實時熒光定量PCR分析Po.WC-1在糙皮側(cè)耳菌絲期在一定光照條件下不同光照時間的差異表達情況。結(jié)果表明，在一定的光刺激下，糙皮側(cè)耳藍光受體Po.WC-1在15 min后的表達量顯著上調(diào)，并且在藍光條件下表達量約是在白光條件下2倍，隨著光照時間的增加表達量逐漸趨于穩(wěn)定，說明光照刺激真菌的生長發(fā)育是一種瞬時反應，這與粗糙脈孢菌等真菌報道的趨勢是相似的[3]。目前的報道中，通過對比粗糙脈孢菌和葡萄孢菌下游靶標基因并沒有同源性，說明不同真菌具有不同的WCC下游靶標基因，不同真菌中光調(diào)節(jié)的途徑是不同的[17-19]，關(guān)于糙皮側(cè)耳內(nèi)Po.WC-1功能以及下游靶標基因還需要進行深入的研究。

綜上所述，初步得到了糙皮側(cè)耳的藍光受體Po.WC-1基因在光照下起到了一定的調(diào)節(jié)作用，為糙皮側(cè)耳光生物學研究奠定了基礎。