基于色質聯用技術的絲織品染料分析新方法

蔡碧瑩 羅曦蕓 徐志珍 夏瑋 張文清

摘要： 文章選用古代常用于染色的六種植物，針對絲織品的染色方法展開研究，擴充建立紅、黃、紫色多組顏色的檢測體系，最終用于鑒定出土絲織品文物上植物染料的組成成分。為解決絲織品文物豐富顏色的分析問題，文章建立了基于自建精確質量數據庫的方法，使用四級桿飛行時間串聯質譜（UHPLC-QTOF-MS），對植物染料的化學成分進行快速鑒定，并探究同位素模式對鑒定結果的影響，增強鑒定結果的準確度和可信性。實驗結果顯示，文章所建立的數據庫可以解決大量出土文物的植物染料鑒定問題，對文物的修復和文化的繼承都具有十分重要的意義。

關鍵詞： 絲織品文物;植物染料;染料顏色;色質聯用;分子數據庫

中圖分類號： TS193.62 ? 文獻標志碼： A ? 文章編號： 1001-7003（2019）06-0012-07 ? 引用頁碼： 061103

Abstract： Six plants which were commonly used for dyeing in ancient times were chosen to study the dyeing method of silk fabrics， and red， yellow and purple testing system was established to identify the compositions of plant dyes on the unearthed silk fabric relics. To solve the problem of rich color analysis of silk fabric relics， the precise quality database was established， and UHPLC-QTOF-MS was used to fast identify the chemical compositions of plant dyes. Meanwhile， the influence of isotope mode on the identification result was explored to enhance the accuracy and credibility of identification results. The experimental results showed that the database established in this study could solve the problem of plant dyes identification on unearthed cultural relics， which is of great significance to the restoration and inheritance of cultural relics.

Key words： silk fabric relics; plant dyes; dye color; UHPLC-QTOF-MS; molecular database

紅色，是中國的傳統顏色，也是人們最鐘愛和崇尚的色彩之一，茜草、紅花、蘇木作為中國古代紅色植物染料具有悠久的歷史[1-3]。黃色，在中國傳統文化里代表帝王之色[4]，姜黃、槐米為古代染制黃色的主要植物染料。紫色，在中國古代是一種極其重要的顏色，常為宮廷所用[5]，紫草為古代染制紫色的主要植物染料。古代絲織品文物植物染料的科學檢測鑒定是中國紡織品科技考古和鑒定工作的重點，明確染色文物染料的種類和植物來源，對文物清洗、修復、復制都有著十分重要的作用。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（UHPLC-QTOF-MS）集合UHPLC快速高效的分離優勢[6]和QTOF質譜高分辨、能采集大量物質信息等特點[7]于一體，既適用于與在線精確質量數據庫聯用，以開發物質的快速篩選和鑒定方法，又可提供全掃描模式下和數據庫匹配的一級質譜母離子的進一步碎片信息。因此，對于復雜成分的分離鑒定具有操作簡便、準確高效的優勢，廣泛應用于植物染料和其他復雜物質的化學成分定性分析中[8-9]。

基于異常珍貴的紡織品文物可供萃取分析的染料纖維極為稀少、含量極低的情況，本實驗采用模擬古代染色方法染制紅色、黃色、紫色真絲織物，并利用自建精確質量數據庫對真絲織物剝色液成分進行分析，從而確定各染料染色真絲織物的有效成分，為實際文物染料成分的定性分析和染料植物的歸屬奠定基礎。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

材料：100%桑蠶絲電力紡（杭州米賽絲綢有限公司），無水乙醇、甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（上海賽默飛世爾科技有限公司），碳酸鉀、檸檬酸、氫氧化鈉、明礬（分析純）、蘆丁（純度>95%）、茜草素（純度>98%）、盧西定（純度>99%）、巴西蘇木素（純度>98%）、姜黃素（純度>98%）、紫草素（純度>98%）均購自國藥集團化學試劑有限公司。茜草、紅花、蘇木、姜黃、槐米、紫草（上海奧淼中藥材有限公司），文物樣品（上海博物館文物保護科技中心）。

儀器：Agilent 1290 UHPLC-6530QTOF-MS/MS（安捷倫科技（中國）有限公司），USC-502型超聲儀和DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），AE24型分析天平（梅特勒-托利多中國），MTN-2800W水浴氮吹儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），WKZ-4型中藥粉碎機（青州市精誠醫藥裝備制造有限公司），Master-S15 UVF超純水儀（上海和泰儀器有限公司），Coloreye XTH手提式色差儀（上海愛色麗有限公司）。

1.2 染色樣品的制備

染色前將桑蠶絲織物在75℃中性水中浸泡20min，并持續攪拌，去掉織物表面可能存在的工業添加物質，用蒸餾水清洗晾干。將染料植物粉碎成20～60目粉末，以增加植物染料與提取溶劑的接觸面積，提高提取率[10-12]。

將10g的槐米浸泡在無水乙醇和去離子水（1 ︰ 1）的100mL混合液中，置于室溫下浸泡24h。將浸泡后的混合物過濾，除去雜質和沉淀物，即得到澄清黃色植物提取液。茜草、蘇木、姜黃、紫草的提取方法同槐米。姜黃、槐米、紫草采用直接染色法，將織物在相應的植物提取液中室溫浸泡12h，水洗晾干后即得到染色織物。茜草、蘇木采用明礬前媒染法，先將織物浸泡在2g/L的明礬水溶液中，媒染溫度為45℃，時間20min，水洗晾干后在相應的茜草、蘇木植物提取液中室溫浸泡12h，水洗晾干后即得到茜草、蘇木染色織物。

將10g紅花加到15℃以下的500mL冷水中，揉搓搗爛后，于陰冷處放置12h，絞擠棄去濾液，再加入500mL冷水揉搓，放置30min，重復若干次后過濾得除去黃色素的紅花。在紅花中加入40mL冷水和04g碳酸鉀，充分攪拌揉搓，放置30min后，用紗布袋過濾得到黃褐色提取液。重復操作2～3次，合并提取液。對提取液邊攪拌邊加入檸檬酸中和，使之為中性。將桑蠶絲織物置于該中性提取液中，染色溫度35℃，染色時間30min。染色后水洗，將其放入含有0.5g/L檸檬酸的水中發色20min，水洗晾干后即得到紅花染色織物。

1.3 染色樣品的處理

采用D65（標準日光，色溫為6500K）光源單方向（45°）照明，同一環境下用色差儀測定染色絲織品的色度值，L、a、b值由Coloreye XTH手提式色差儀采集記錄，并計算不同批次染色織物的色差值（ΔE），ΔE=[（ΔL）2+（Δa）2+（Δb）2]1/2。

準確稱取染色絲織品樣品各（10±1）mg置于10mL離心管中，茜草、紅花、蘇木、紫草染色后的織物加入1mL甲醇 ︰ 丙酮 ︰ 乙酸（2 ︰ 2 ︰ 1）剝色溶液，姜黃、槐米染色后的織物加入1mL甲醇 ︰ 乙酸（1 ︰ 1）剝色溶液，80℃超聲提取50min。將剝色提取液氮吹至完全吹干，再加甲醇復溶到150μL，用1mL注射器吸取剝色提取液，用0.22μm有機相濾頭過濾后進行色譜分析。

1.4 精確質量數據庫的建立

將60種植物染料成分的分子式和名稱整理成表，保存成csv格式的文件。將該文件導入Agilent MassHunter （Version B.06.00， Agilent， USA） 高級質譜處理軟件的個人物質數據庫及圖書館（Personal Compound Database and Library， PCDL）模塊中，軟件可自動計算其相對分子質量（精確到小數點后四位），即生成了精確質量數據庫（accurate-mass database），用于一級質譜中的分子式匹配。此外，一級質譜中所得到的各物質的保留時間可以繼續導入PCDL，以增強后續二級質譜的針對性。

1.5 LC-MS分析條件

1.5.1 UHPLC參數

色譜柱：Agilent Extend C18 UHPLC reversed-phase column （2.1mm×50mm，1.8μm），柱溫30℃，流速0.25mL/min，進樣量1μL;流動相：A路為0.1%甲酸的水溶液，B路為乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～9min，A路比例由95%下降到5%;9～10.3min，A路比例為5%;10.3～10.5min，A路比例由5%上升到95%;檢測波長280nm。

1.5.2 QTOF參數

采用QTOF模式的負離子模式掃描（ESI-）采集樣品的一級質譜數據，優化好的質譜參數如下：霧化氣溫350℃，霧化器流速10L/min，霧化氣壓30psig，毛細管電壓3000V，毛細管出口電壓150V，掃描范圍50～1000amu。內標校正離子：m/z 112.9859 和1033.9881，對分析結果進行實時質量校正。目標二級離子模式（Targeted MS/MS）的碰撞電壓值，依據目標離子碎裂的難易程度設定為20eV和30eV。

2 結果與分析

2.1 染色結果

CIELAB色空間是由國際照明委員會（CIE）建立的一種色彩空間，由反映色彩范圍的三通道組成[13]。在該空間中L為明度，L值越大表示顏色越白，L值越小表示顏色越黑;a、b為色度坐標，其中a為正值表示顏色偏紅，a為負值表示顏色偏綠;b值為正值表示顏色偏黃，b值為負值表示顏色偏藍。不同批次所染織物的顏色特征值和顯色效果如表1所示，其色差變化值均小于1.5個NBS色差單位，目測難以發現色差，說明染色方法重復性較高。在紅色織物中，紅花染制的織物色度值a最高，茜草媒染后的織物偏橙黃色，蘇木媒染后的織物為深紅色。在黃色織物中，姜黃上色效果最明顯，b值達到81.67，槐米染制的織物為嫩黃色。

2.2 染料成分的分析

2.2.1 剝色提取液的鑒定過程

取各染色絲織品剝色液的混合液，進行色譜條件優化。該過程不同于普通液相色譜：在不同液相條件下，分別進行一級質譜自動分子式匹配，匹配色譜峰數量最多的色譜條件即為最優條件。使用優化好的色譜條件分離后，首先進行一級質譜自動分子式匹配。由于大部分染料成分在負離子模式下均可獲得較好的電離，故選用負離子模式，使用m/z 1129859和1033.9881的兩個內標校正離子，對分析結果進行實時質量校正;并設定分數值小于60.0的分子不執行匹配。共匹配到28種物質，選取分數高于85.0的物質共16種，進一步進行二級質譜匹配。

將各分子離子峰的測定m/z值、一級質譜模式下的保留時間和誤差時間（設定為0.5min，即原保留時間±0.5min的保留時間范圍內，捕捉到的設定質量數的分子離子均可被進一步碰撞，以避免保留時間漂移造成漏檢）保存成csv格式的文件，導入MassHunter，即為二級質譜數據庫，QTOF可自動按照該數據庫提供的母離子質荷比及保留時間范圍等信息，碰撞指定離子，得到它們的子離子信息。將每一種物質的子離子按照碎裂規律進行歸類，并將其m/z值與文獻、數據庫和標準品對照，實現染色樣品剝色液中各物質的結構鑒定。以Aliazrin為例，其分數值為99.55（圖1（a）），使用提取離子流圖模式，可得到其色譜圖，進一步施加碰撞能量，產生子離子（圖1（b）），將其與文獻值和標準品的一級和二級質譜數據對照，確定其為Aliazrin。

2.2.2 關于同位素模式和分數值的討論

為保證數據庫匹配結果的可靠性，需要進一步對匹配結果進行篩查。由于天然同位素的存在，負離子模式下的質譜圖除分子離子峰A外，還會出現多種同位素離子峰，對應的m/z值分別為A+1、A+2等。因此，在同位素模式下，一個分子離子峰的同位素離子豐度和幾個同位素離子峰的峰間距理論值可以成為判定其分子結構的重要依據。

數據庫匹配的得分數由三個因素決定：質量數（即得到的分子離子峰的m/z值是否符合理論值），同位素豐度（即得到的同位素離子的豐度是否符合理論計算值）及同位素峰間距（即得到的同位素離子的峰間距是否符合理論計算值）。分數值由以上三個因素加權計算得到，范圍在0～100，分數越高，一級匹配的準確度越高。通常情況下，分數超過60分，則表明匹配得到的分子式是正確的。比如，在對Brazilin（結構見圖2，分子式為C16H14O5）的一級質譜鑒定過程中，其理論[M—H]-的m/z值為285.0768，實際測定值為285.0767，相差僅0.0001（一般在高分辨質譜中，測定值與理論值相差小于0.0010才能認為質量數匹配），表明得到的分子離子峰的m/z值符合理論值;同位素的豐度和間距均在軟件的預測范圍內。測定結果在質量數、同位素豐度和同位素間距這三個方面匹配程度均非常高，因此加權得到的分數值也非常高，達到了99.10，表明分子式匹配結果是正確的，可以進行后續的二級質譜測定。

2.2.3 剝色液成分鑒定結果

得到的二級質譜碎片信息與文獻和質譜數據庫網站（Chemspider， http：//www.chemspider.com/）進行對比，以實現各物質的鑒定。部分物質通過標準品的UHPLC保留時間、一級質譜和二級質譜碎片m/z加以證實。經過標準品比對及文獻對照，一共鑒定出10種物質，它們的保留時間、[M—H]-精確質量數、特征子離子碎片、分子式和分數值見表2。

2.2.4 實際文物鑒定結果

古代樣品在成分未知的情況下，不可能選用對染料最合適的剝色溶劑。但根據顏色可做出初步判斷，根據樣品纖維表觀顏色為紅色，最終采用同蘇木等紅色絲布的剝色方法，樣品處理方法見1.3。經過數據庫的匹配分析，實際文物樣品中含有茜草染制絲織物的特征染料成分羥基茜草素（Purpurin）和茜草素（Aliazrin），且匹配分數高達98.94%和98.85%，推斷染料植物為茜草。由于此次可供液質分析的文物樣品纖維十分稀少，一級質譜信號強度低僅為102，不宜進行后續二級質譜分析，但通過數據庫的匹配可篩選出特征染料成分，從而進一步推斷染料植物。

3 結 論

1）與分析植物染料提取液相比，采用自染色自剝色的方法更接近實際文物的分析過程。通過對染色絲織品中植物染料成分進行準確鑒定，可使染料分析形成更完整的體系，以解決更多出土文物的植物染料鑒定問題，為后續研究奠定基礎。

2）與傳統液質聯用方法相比，本文基于自建精確質量數據庫并采用高分辨質譜軟件下的同位素模式，通過給出特征同位素分布，可大大縮小假設的原子組成范圍，從而增強了鑒定結果的準確度和可信度。即使在嚴重缺乏標準品的情況下，也可基本保證分子式匹配結果的正確性，進一步減小后續的結構鑒定和物質篩選的難度。對于類似體系，如其他植物提取物的快速鑒定，也同樣具有一定的普適性和應用價值。

參考文獻：

[1]FORD L， RAYNER C M， BLACKBURN R S. Degradation of lucidin： new insights into the fate of this natural pigment present in Dyers madder （Rubia tinctorum L） during the extraction of textile artefacts [J]. Dyes and Pigments， 2018， 154： 290-295.

[2]LOMBARDI L， SERAFINI I， GUISO M， et al. A new approach to the mild extraction of madder dyes from lake and textile [J]. Microchemical Journal， 2016， 126： 373-380.

[3]徐方圓， 吳來明， 施超歐， 等. 博物館照明對蘇木染色絲綢的影響研究[J]. 文物保護與考古科學， 2017， 29（1）： 8-13.

XU Fangyuan， WU Laiming， SHI Chaoou， et al. The effect of museum lighting on fading of Caesalpinia sappan dyed silk [J]. Sciences of Conservation and Archaeology， 2017， 29（1）： 8-13.

[4]呂海霞， 徐雪萍， 徐方圓， 等.染色絲織品的植物染料提取工藝優化[J]. 絲綢， 2017， 54（1）： 1-8.

L Haixia， XU Xueping， XU Fangyuan， et al. Optimization of plant dye extraction process of dyed silk fabrics[J]. Journal of Silk， 2017， 54（1）： 1-8.

[5]LUCA E D， REDAELLI M， ZAFFINO C， et al. A SERS and HPLC study of traditional dyes from native Chinese plants [J]. Vibrational Spectroscopy， 2018， 95： 62-67.

[6]HAN J， WANROOIJ J， BOMMEL M V， et al. Characterisation of chemical components for identifying historical Chinese textile dyes by ultra high performance liquid chromatography-photodiode array-electrospray ionisation mass spectrometer [J]. Journal of Chromatography A， 2017， 1479（6）： 87-96.

[7]ZHOU J， YI H， ZHAO Z X， et al. Simultaneous qualitative and quantitative evaluation of Ilex kudingcha C J tseng by using UPLC and UHPLC-qTOF-MS/MS [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2018， 155（5）： 15-26.

[8]SINGH J， JAYAPRAKASHA G K， PATIL B S， et al. An optimized solvent extraction and characterization of unidentified flavonoid glucuronide derivatives from spinach by UHPLC-HR-QTOF-MS [J]. Talanta， 2018， 188（1）： 763-771.

[9]ZHU L X， XU J， ZHANG S J， et al. Qualitatively and quantitatively comparing secondary metabolites in three medicinal parts derived from Poria cocos （Schw） Wolf using UHPLC-QTOF-MS/MS-based chemical profiling [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2018， 150（20）： 278-286.

[10]崔巖， 劉元風， 鄭嶸. 蜀錦的紅花染色工藝研究[J]. 絲綢， 2016， 53（10）： 23-27.

CUI Yan， LIU Yuanfeng， ZHENG Rong. Research on safflower dyeing technology of Shu brocade[J]. Journal of Silk， 2016， 53（10）： 23-27.

[11]吳國輝. 植物染料的分類及提取研究[J]. 染整技術， 2017， 39（3）： 7-9.

WU Guohui. Research of classification and extraction of plant dyestuff[J]. Textile Dyeing and Finishing Journal， 2017， 39（3）： 7-9.

[12]韓婧， 張曉梅. 模擬古代絲織品上天然染料剝色研究[J]. 文物保護與考古科學， 2012， 24（1）： 5-11.

HAN Jing， ZHANG Xiaomei. Studies on the extraction of dyes on ancient textiles [J]. Sciences of Conservation and Archaeology， 2012， 24（1）： 5-11.

[13]MCGRATH J R， BECK M， HILL M. Replicating red： analysis of ceramic slip color with CIELAB color data [J]. Journal of Archaeological Science： Reports， 2017， 14： 432-438.