血友病鼠模型的構建及研究進展

李 杰， 閆振宇,2*

(1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000)

血友病 (hemophilia) 是由編碼凝血因子VIII(coagulation factor VIII，FVIII)和(或)凝血因子IX(coagulation factor IX，FIX)的基因突變，引起的一組X連鎖隱性遺傳性疾病。這種遺傳缺陷引起體內FVIII和(或)FIX的缺乏或者功能缺陷，從而導致體內凝血功能障礙，嚴重威脅患者的生命健康[1]。疾病可分為由FVIII功能異常導致的血友病A (hemophilia A，HA)與由FIX異常所致的血友病 B (hemophilia B，HB)，絕大多數血友病患者為男性。研究數據表明，在5000男性活嬰中大約就有1人為HA患者[2]。相比于HA，HB發病率較低，在男性中發病率約為1/25 000[3]。血友病的臨床表現主要為反復出血及因血腫壓迫所導致的軀體畸形等，嚴重時可能因顱內部位出血導致患者面臨生命危機。該疾病目前尚無有效的治愈方法。血友病的治療先后經歷了從二戰時期開始的全血及新鮮冰凍血漿的輸注，到冷沉淀，凝血酶原復合物及凝血因子制劑等治療手段。但是這些血液制品等長期輸注，導致了血源性傳染性疾病等發病幾率的大大提高。國外學者曾有報告[4-5]，在20世紀80年代末的美國，受污染的血液制品導致近50%的血友病患者感染艾滋病。血漿源性凝血因子或基因重組凝血因子的應用雖然可以降低血源性傳染病發生的幾率，但是長期使用后體內易產生抗體，即抑制物。這種抑制物的產生，是替代治療的嚴重并發癥。研究表明，血友病患者體內抑制物的出現，將大幅度降低輸注FVIII、FIX制劑的治療效果，患者出血頻率增加，出血癥狀較前明顯加重，治療更為困難[6]。另一方面高昂的費用使得終生預防性治療難以廣泛開展[7-8]。臨床方面需要新的治療手段來減少患者疾病及經濟負擔，需要尋找治愈血友病的治療方法。血友病作為單基因遺傳性疾病中的一種，基因治療有望成為血友病患者凝血因子濃縮物的治愈療法，并在國際上得到廣泛關注。

在基因治療中，血友病動物模型的構建在治療研究中具有重要的基礎支持作用。血友病鼠模型的構建成功，極大的促進了血友病基因治療的研究進展。現就血友病鼠的構建及研究進展予以綜述。

1 血友病小鼠模型的初次構建

70余年前，科學家在自然界中，發現了一種具有類似血友病臨床表型的狗，在發現之后，這種狗經過保種、繁育直至1989年，基因技術有了一定進展，才被證實這種狗因體內編碼FIX的基因突變導致該凝血因子活性喪失，其發病機制及臨床病理方面與人類HB極為類似，從而成為了血友病基因治療的動物模型[9]。

1998年，Monahan等[10]發表文獻，用這種天然的血友病犬模型進行基因治療的臨床前動物試驗，獲得了令人滿意的結果。但是考慮到這種動物模型資源有限，價格高昂，并且在取材方面費時、費力，這種血友病犬模型不能較為廣泛的應用于實驗研究。所以，需要進一步找尋或者是構建其它動物模型，供應研究使用。隨著基因技術的發展，“基因打靶”已成為一個熱點。所謂“基因打靶”是指通過將目標細胞中的外源DNA和染色體DNA的同源序列進行同源重組,從而達到修飾染色體上特定基因的目的[11]。這種基因修飾方法被廣泛應用于研究中。

早在1992年，Hooper等[12]通過應用小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES) 基因打靶技術，成功地對小鼠基因組中的片段進行設計及修飾，并且這種修飾后的基因在整體動物水平中得到表達，并且在后代中仍可發現，表明其可以進行基因的傳遞。在此之后，有文獻指出[13-14]，依據基因打靶原理，美國科學家使用ES細胞同源重組技術將Neo基因分別插入編碼小鼠mFVIII的基因外顯子16和外顯子17的3′末端，成功獲得HA小鼠模型。

隨后，國外學者使用基因敲除方法將mFIX基因敲除，在1997年成功建立了HB小鼠模型[15]。在同一時期，在血友病的基因治療研究中，我國也取得了巨大的研究進展[16-17]。但是，這也要求適合的血友病動物模型的產生，來進一步完善臨床前實驗，評估基因治療的安全性及有效性。1998年，戴旭明等[18]根據基因打靶的基礎原理，成功地構建針對小鼠mFIX基因的基因打靶置換型載體pMFIX DEL，并于同年報道，利用該載體進行定向敲除小鼠ES細胞中mFIX基因，培育出缺乏mFIX小鼠，奠定了建立HB的轉基因小鼠模型的基礎[19]。

2 血友病小鼠模型特點的研究

隨著血友病小鼠模型的構建成功，對于血友病的基因治療起了重要作用，同時研究人員也對這種模型是否適用基因治療，進行了探討及深入研究，最終證實其模型確實適用，并對于基因治療具有極大的推動潛能。例如，我國學者于1999年發表文獻[20]指出，mFIX基因剔除小鼠在繁殖過程中，沒有發現突變的基因具有重新回復為正常基因的趨勢，也沒有觀察到未被敲除的負責編碼mFIX的基因部分被RNA轉錄，并合成蛋白的現象，從而證明這種基因剔除小鼠具有遺傳穩定性。同時在該研究中，通過測得凝血功能及凝血因子活性結果，證實這種血友病小鼠模型符合標準，適用于此后的深入研究。另外也指出，測量方式的正確選擇對于指標的判讀非常重要。孫偉等[21]對于血友病鼠的飼養及保種進行研究，他們經過4年的時間，通過對mFIX基因剔除小鼠采取選優法，并對于生長、繁殖及臨床表現等研究發現，這種動物模遺傳符合孟德爾分離及自由組合定律，從而也證明了其遺傳具有穩定性的特點，為進一步的實驗研究提供寶貴的證據。此后，他們在2003年報道[22]，經過12代血友病小鼠模型的飼養及選育工作，建立了成熟的mFIX基因剔除小鼠的近交系；在研究和充分觀察血友病小鼠模型的過程中，發現mFIX基因敲除小鼠具有低離乳率和高死亡率，考慮與該動物模型本身有出血傾向有關，指出在培育及飼養時，應將構建好的模型小鼠放于單籠精心喂養。該試驗為以后的血友病小鼠模型的研究提供了科學的數據支持，并提供了該動物模型的選育及保種等方面的寶貴的實驗依據。

3 血友病小鼠模型的改進

隨著基因技術的不斷發展，人們認識到，位于不同區域的基因或者是不同類型的基因發生改變，往往會產生不同類型的結果。對于血友病這種疾病來說，更是如此。不同區域基因的變化導致凝血因子產生過程中的相應異常，對于體內凝血因子的活性及功能產生不同的影響。這種情況可能造成了血友病的臨床治療方面所遇到的種種問題。這些問題可能與患者的遺傳差異導致的凝血因子表型的不同有關[23-25]。

根據研究，血友病主要由點突變和基因缺失引起[26-27]。傳統的小鼠血友病模型是基于基因打靶原理，用同源重組載體代替大片段，利用大片段的缺失造成mFIX基因的遺傳缺陷[15]。由此產生的HB小鼠模型通常不適合進一步的研究和應用，因為DNA的大規模缺失導致對鄰近基因的影響。這就要求要有新型的血友病動物模型的產生，以適應研究進展。車文良等[28]于2002年指出，通過在mFIX基因剔除小鼠的基礎上，對含hFIX基因的表達載體引入點突變，在mFIX基因剔除小鼠受精卵雄原核上導入線性化的pMe4bAIXml質粒(此質粒為研究中通過采用體外定點突變技術制備的一種含有IX基因的表達載體)。在小鼠出生后，測定結果顯示小鼠體內含有目的基因，說明成功地構建出了HB小鼠模型，這種動物模型是對于之前的傳統的基因打靶法構建血友病小鼠模型進行的改良。

盡管早在上世紀90年代，HA小鼠模型就初次構建成功，但是對于我國科學研究者來說，這種動物模型在引進手續、費用等方方面面的問題制約著國內研究的發展。為此，我國學者努力嘗試制備血友病鼠模型。并于2010年指出，成功構建了我國第一例HA小鼠模型。在實驗研究中，匡穎等[29]通過采用ET克隆、胚胎干細胞同源重組和四倍體囊胚補償技術繁育小鼠后，測量各項指標，該動物模型符合HA的臨床表型，適用于HA的研究，這種HA小鼠模型的成功建立，為以后的研究創造了可靠的實驗支持條件，提供了可靠的實驗依據，促進了基因治療的發展。

在此之后，隨著各種技術展開，研究方面的深入等，逐漸出現了以鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)為核心的基因編輯技術和以類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)為核心的基因編輯技術。有研究指出，ZFN基因編輯技術，因其設計復雜，脫靶效應高等缺點，尚需完善[30]。

4 鋅指核酸酶技術構建血友病鼠模型

2014年，國外學者指出[31]，通過ZFN技術構建了血友病大鼠模型，相比于血友病小鼠模型，其采血量及自發性出血等方面的問題得到解決，推測其適用于實驗研究。其后，在該鼠模型的基礎上進行其它有關血友病疾病等方面的深入展開。2016年，S?rensen等[32]指出,他們在血友病大鼠模型的基礎上構建出血友病性關節炎的動物模型，推動了血友病性關節炎的進一步研究。同年，L?vgren等[33]也指出，在血友病大鼠中，關節出血將使應用FVIII制劑時，抗體(即抑制物)的產生幾率增加，進一步加重疾病負擔。2018年，Christensen等[34]在血友病關節炎鼠模型的基礎上進行研究，并指出血友病患者關節軟骨和骨退化，與血流有必要的相關性，而不僅僅是炎癥的影響。

5 CRISPR/Cas系統構建血友病鼠模型

CRISPR，全稱為“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”，是一種廣泛地存在于細菌及古細菌的基因組中的DNA重復序列；Cas是CRISPR的臨近的相關基因。CRISPR是1987年日本學者[35]在研究大腸桿菌堿性磷酸酶基因時首次發現的；其具有14個長度為29 bp 的重復片段和32～33 bp 的非重復片段，這些片段以間隔的方式連接以形成短回文重復序列結構。但是當時限于種種原因，未予重視，并沒有深入的進行研究。直到2002年它才正式命名為“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”，即“CRISPR”[36]。此后，對于CRISPR的研究逐漸開展。至2013年，CRISPR作為一種基因編輯技術由《Cell》報道出來，該技術稱為“CRISPR/Cas9 介導的打靶系統”[37]。CRISPR/Cas9系統原本是一種在長期演化過程中形成的獲得性免疫防御系統，經過人工改造，CRISPR/CAS9系統已成為以RNA導向的基因組編輯技術；該系統可分為I型、II型、III型三種類型[38-39]。其中，II型CRISPR/CAS系統由于其相對簡單的工作組成而廣泛用于基因編輯或基因沉默。該技術對比于之前已有技術，具有著其自身的優勢。在此之后，該技術被廣泛應用于各個科學的研究中[40-55]。

CRISPR/Cas 系統基因編輯技術的發展，對于基因修飾小鼠模型的構建具有著極大的促進作用。例如：2014年，馬元武等[56]在研究胰島素受體底物1(IRS1)基因與代謝病之間的關系，通過CRISPR/Cas 系統構建成功Irs1基因敲除大鼠，為研究提供了必要的動物模型。2015年白敏等[57]指出，利用CRISPR/Cas9 技術，成功構建了一種小鼠模型，這種小鼠模型具有特定的位點突變。同年，李彥鋒等[58]通過CRISPR/Cas系統靶向敲除Fscb基因，構建成功Fscb基因敲除小鼠模型，為進一步研究FSCB蛋白在精子鞭毛運動和獲能中的作用奠定了基礎。王偉等[59]通過CRISPR/Cas9 系統靶向敲除技術成功建立了Tlr3基因敲除小鼠模型。這些研究指出CRISPR/Cas系統基因編輯技術在小鼠或者是大鼠體內是可行的，提供了可行性的證明，同時也為血友病鼠模型的構建改良提供了思路。使研究人員認識到可以應用CRISPR/Cas系統原理構建血友病即凝血因子基因敲除小鼠。

汪啟翰等[60]于2013年提出應用CRISPR/Cas 系統構建HB小鼠模型，在研究中，利用CRISPR系統, 在mFIX基因第8外顯子核心功能區設計一個靶點，通過體外轉錄Cas9酶及gRNA并顯微注射小鼠單細胞期受精卵進行mFIX定點的基因編輯。通過測量各項指標，較為符合血友病表型。緊隨其后，于2015年[61]發表文獻指出，依據CRISPR/Cas 系統基因編輯技術，進行mFIX基因敲除，成功構建的HB小鼠模型。在此研究中，也證實了減少CRISPR/Cas 系統基因脫靶效應的方法，即通過對Cas9 核酸酶蛋白的切割域進行突變，利用修飾型的Cas9 核酸酶斷裂DNA雙鏈的其中一條鏈[62]。2016年，關玉婷[63]發表文獻，利用CRISPR/Cas9技術將Cas9基因、sgRNA和ssODN注射到小鼠單細胞胚胎中，成功構建了模擬病人新突變的點突變小鼠F9Y381D。同時還成功制備了F9Y381S突變小鼠及第383位氨基酸突變為終止密碼子的敲除小鼠F9383STOP。同年，常士偉[64]指出，通過CRISPR/Cas9技術能夠成功的制造出FVIII基因敲除即HA小鼠模型。這兩個研究進一步證明CRISPR/Cas9技術在血友病小鼠模型的制作中，具有著強大的執行力。

6 總結及展望

血友病作為一種常見的血液性疾病，對于患者極易造成軀體畸形，嚴重時甚至危及生命。目前尚無治愈方法，我國治療手段主要為替代治療，療效不持續，治療費用高昂，我國患者絕大多數不能承擔終身性預防治療。其作為一種單基因遺傳性疾病，基因治療是最有望成為其治愈的方法。最早于1987年開始，國際上就有關于血友病基因治療的研究展開。隨著研究的深入開展，血友病動物模型成為其不可或缺的一種必要條件。即使在自然界種存在天然的血友病動物，但其資源有限，獲取困難，不易于廣泛地推展于實驗研究。因此，人為構建血友病動物模型是大勢所趨，也是勢在必得。在這些動物模型種，小鼠模型具有其自身的特點，易于獲得，便于運輸，研究費用較其它大型動物來說，要少于其它動物。這些特點使其在血友病動物模型的構建中脫穎而出。血友病小鼠模型從開始制備到如今已有20多年的歷史，經歷了多種基礎原理的發展，多種技術手段的支持。或許直至今日，血友病小鼠模型的構建技術仍有不足之處，如CRISPR/Cas9技術的脫靶效應等，這種動物模型仍具有種種尚未發現的需繼續改善的缺陷。但是不可否認，這種動物模型的構建，為血友病的研究提供了不可替代的支持條件，加快了血友病的基因治療的研究步伐，促進了血友病的研究進展。截止目前，血友病的基因治療研究尚具有不足，尤其是HA的研究進展緩慢。研究人員期待有新原理的提出，新技術的產生，應用于血友病動物模型的構建，推動血友病基因治療的進展。