切花菊苗期抗寒性評價及相關的分子標記挖掘

徐婷婷 馬 杰 遲天華 葉 丹 管志勇 房偉民 陳發棣 張 飛

(南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095)

低溫是影響植物地理分布和生長發育的重要環境限制因子之一。對觀賞植物而言，低溫不僅會影響其生長發育，嚴重時還會引發凍害，影響花型、花色等觀賞性狀表達，降低觀賞品質和經濟效益[1]。菊花(Chrysanthemum morifolium)為菊科菊屬多年生宿根花卉，是我國十大傳統名花和世界四大切花之一，觀賞和經濟價值較高，在花卉生產中占有重要的地位。冬季長期低溫使菊花品種開花延遲[2]，影響成花品質，特別是在切花菊周年生產中，冬季加溫增加生產成本、污染環境。因此，迫切需要挖掘利用抗寒基因資源、培育抗寒新品種以解決切花菊冬季高效生產，實現節本增效。

目前，關于菊花抗寒性的研究主要集中在評價體系[3-4]、生理機制[5-7]、優異基因挖掘[8-11]和種質創新[12-15]等方面，而對菊花抗寒性分子標記的相關研究尚鮮見報道。為明確切花菊抗寒性的遺傳變異，挖掘優異抗寒基因資源，本研究利用電導率結合Logistic方程評價了83個切花菊品種苗期葉片的低溫半致死溫度(semi-lethal temperature，LT50)，并結合前期報道的分子標記數據[16]通過關聯分析挖掘與抗寒性相關的優異等位變異位點，并篩選抗性品種資源，以期為菊花抗寒性的遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為83個切花菊品種(表1)，均由南京農業大學中國菊花種質資源保存中心提供。于2017年8月初采取插穗進行扦插，8月下旬定植于南京農業大學花卉基地湖熟現代農業示范園，進行常規管理。

1.2 低溫處理與相對電導率的測定

參照郭海林等[17]的方法并略加改進，于苗期采集83個切花菊品種的葉片，每個品種15片，采集葉片的位置和大小基本相同，去離子水漂洗3次，再用去離子水浸潤的紗布包裹葉片后置于試管內，4℃冷藏過夜[18]。次日利用9610型低溫循環儀(Polyscience公司，美國)進行低溫處理。低溫循環溫度梯度分別設置為 3、0、-3、-6 和-9℃，處理時間均為 1 h，勻速降溫30 min，每個低溫處理結束后，取出試管于4℃冰箱內解凍，低溫處理結束后將每個低溫處理的葉片分裝于試管，加入25 mL去離子水浸泡15 h，利用DDS-307型電導率測定儀(上海雷磁儀器有限公司)測定葉片煮沸前電導率，沸水浴15 min后冷卻至室溫并測定電導率，按照公式計算各處理的相對電導率(relative electric conductivity，REC):

每處理3次重復，取平均值。

1.3 低溫半致死溫度

利用相對電導率擬合Logistic回歸方程計算低溫半致死溫度LT50(℃)。回歸方程為:

式中，Y:細胞傷害率；x:低溫處理溫度；K:細胞傷害率的飽和容量；a、b:均為方程參數。將方程進行線性化處理以此確定a，b值，ln[(K-y)/y]=ln(a-bx)，令y=ln[(K-y)/y]，則轉化為細胞傷害率(y)與處理溫度(x)的直線方程。參照許瑛等[4]的方法，通過線性化處理和直線回歸的方法求出 a、b值及擬合度(R2)，半致死溫度 LT50=In[(1/a)]/b。采用 SPSS v20軟件進行LT50的描述性統計分析和聚類分析。

1.4 切花菊耐寒性與分子標記關聯分析

基于Li等[16]報道的707個 SRAP、SSR、SCoT等分子標記數據，利用STRCTURE v2.3.3軟件評價83個切花品種進行群體結構(K=2)及各品種的Q值；利用SPAGeDi v1.4軟件進行親緣關系分析，得到親緣關系系數Kinship矩陣(86.9%品種間親緣關系系數小于0.1)。在此基礎上，利用TASSLE v5.0軟件中的混合線性模型(mixed linear model，MLM)進行抗寒性(LT50)與分子標記的關聯分析，同時將群體結構分析中得到的各品種的Q值和親緣關系分析中得到的Kinship矩陣作為協變量計入模型中，若P＜0.01則認為標記位點與目標性狀有顯著關聯。基于關聯分析得到的顯著位點，計算出每個位點等位基因缺失和等位基因存在的LT50均值，用等位基因存在的LT50均值減去等位基因缺失的LT50均值，從而得到每個位點的表型效應值[19-20]。LT50越小，抗寒性越強，并據此判斷表型效應值為負值的位點為有利等位變異位點。

2 結果與分析

2.1 Logistic回歸模型的建立及LT50的確定

根據供試材料在不同低溫處理下的相對電導率得到Logistic曲線、Logistic方程及其擬合度和半致死溫度。電解質漏滲率測定結果以切花菊品種Qx151為例(圖1)，5 個點對應的溫度分別為 3、0、-3、-6 和-9℃，REC隨著溫度的下降而逐漸上升，其中3～-3℃時，隨著溫度的降低電解質滲出率較快；-3～-6℃時電解質滲出率上升比較緩慢；-6～-9℃時電解質滲出率基本趨于穩定，隨著溫度的降低，相對電導率的變化呈明顯的S型曲線，拐點溫度即為半致死溫度。由表1可知，所有供試材料模擬Logistic方程的擬合度均達到顯著水平，LT50的變化范圍為-10.99(Qx-097)～1.86℃(Qx-007)。

圖1 不同低溫處理后切花菊Qx151離體葉片電導率擬合Logistic方程曲線Fig.1 Logistic equation based on REC from detached leaves of QX151 after different low temperature treatments

表1 83個切花菊的相對電導率回歸方程及低溫半致死溫度(LT50)Table1 REC logistic equation and LT50of the 83 cut chrysanthemum cultivars

表1(續)

表1(續)

2.2 菊花苗期耐寒性的表型數據

由表2可知，切花菊的 LT50介于-10.99～1.86℃之間，平均值為-4.31℃，變異系數為79.81%，離散程度較大，說明切花菊品種的耐寒性差異較大。LT50在供試材料中的偏度和峰度分別為-0.68和0.91，絕對值均小于1，表明切花菊苗期耐寒性屬于多基因控制的數量性狀。

表2 83個菊花品種苗期耐寒性(低溫半致死溫度)的描述性數據Table2 Descriptive statistics for cold tolerance(LT50)of 83 cut chrysanthemum cultivars at seedling stage

2.3 LT50的聚類分析

依據LT50對83個切花菊品種進行聚類分析，由表3可知，83個切花菊品種的抗寒能力分為四類:第一類抗寒型，LT50低于-7.38℃，包括 Ox-011、Ox-114、Ox-054等18個品種，占供試材料的21.67%；第二類中抗寒型，LT50為-6.51～ -4.45℃，包括 Qx-006、Qx-034、QD-005等19個品種，占供試材料的22.89%；第三類低抗寒型，LT50為-4.27～-2.17℃，包括 Ox-030、南農紫唇、Ox-146等27個品種，占供試材料的32.53%；第四類不抗寒型，LT50為-1.78～1.86℃，包括 QD007、南農紅霞、南農玉珠等 19個品種，占供試材料的22.89%。

表3 83個切花菊品種的LT50聚類分析結果及抗寒能力Table3 Clustering result of LT50and cold resistance for 83 cut chrysanthemum cultivars

2.4 抗寒性相關的分子標記

基于MLM方法的關聯分析共計檢測到11個標記位點與品種的耐寒性顯著關聯(P＜0.01)，單個關聯位點的表型效應值為-3.51～0.83，表型變異解釋率為11.37%～18.83%(表4)。 其中，E2M16-1、E2M16-4和E2M16-8的效應值為正，為抗寒性不利位點；其余8個關聯位點的效應值為負，為抗寒性有利位點。由8個增效位點的箱線圖(圖2)可知，僅位點E7M12-13在P＜0.01水平顯著。結合LT50表型數據，攜帶該位點且抗寒性較好的品種有南農金檸檬、Qx097、QD028、Qx049、Qx153 和 Qx008。

3 討論

抗寒性是菊花重要育種目標性狀之一，抗寒基因資源的挖掘和利用是開展抗寒育種的重要前提。Dexfer等[21]首次釆用電導法進行植物抗寒性評價，發現植物組織受寒害程度越高電導率越大。由于不同物種之間電解質豐度不同，相對電導率比電導率更能準確的表達組織受傷害的程度[22-23]。細胞電解質滲出率為50%時的溫度則為該材料的低溫半致死溫度，將相對電導率結合Logistic方程回歸分析計算LT50已成為評價植物抗寒性的常用方法[24-28]。Kim等[3]通過測定LT50和腳芽生長量鑒定了菊花的抗寒性；許瑛等[4]通過菊花腳芽葉片相對電導率結合LT50評價了菊花在秋冬季不同降溫時期的抗寒性；王翠麗等[29]發現菊花葉片亞麻酸/(亞油酸和油酸)比值可作為評價秋菊抗寒性的有效指標，且認為不飽和脂肪酸含量結合LT50可快速鑒定抗寒菊花品種。上述研究表明，LT50是菊花抗寒性鑒定評價的重要參考依據之一。本研究通過LT50評價了83個切花菊品種的抗寒性，發現LT50離散程度較大(變異系數為79.81%)，并篩選到部分抗寒品種資源，為后續抗寒育種利用提供了重要親本材料。

表4 在P＜0.01水平下與抗寒性顯著相關的標記Table4 Markers significantly associated with cold tolerance at P＜0.01 level

關聯分析是開展數量性狀遺傳研究的重要手段之一[30-32]，已成功用于挖掘植物抗寒優異基因資源或等位變異。Huang等[33]利用關聯分析在玉米發芽期和苗期檢測到40個SNP與10個抗寒性狀相關；Visioni等[34]通過關聯分析挖掘到2個大麥抗寒相關SNP與已知QTL位點重疊。近年來，關聯分析在菊花耐澇性[20]、抗蚜性[35]和其他園藝性狀[18，36]優異等位變異挖掘中均有相關報道。本研究基于前期報道的707個分子標記[18]，利用MLM法挖掘到8個抗寒相關有利位點，其中有1個分子標記位點(E7M12-13)的表型效應值達到顯著水平(P＜0.01)。結合LT50表型數據，發現攜帶E7M12-13位點且抗寒性較好的品種有南農金檸檬、Qx097、QD028、Qx049、Qx153 和 Qx008，均可作為重要的親本材料加以利用。此外，通過與 Li等[16]研究比較，發現本研究中有3個抗寒性相關標記位點(E2M16-2、E2M16-1和 E11M23-14)分別與花期、花頸長度和葉緣鋸齒相關。鑒于抗寒性與這些園藝性狀是不同類型的性狀，推測可能是由于連鎖引起的。這為今后通過間接篩選耐寒品種提供了初步證據，同時也為改良菊花耐寒性和其他園藝性狀提供了理論依據。本研究利用了707個SRAP、SCoT等多態性分子標記位點，但檢測到的抗寒性相關等位變異位點主要集中在 E2M16、E7M12和 E11M23等 3對SRAP引物組合擴增出的多態性位點中，說明這些顯性標記位點在抗寒性關聯分析中有其局限性。因此，在今后研究中應進一步利用基于高通量測序的SNP等分子標記開展相關研究，為高效挖掘菊花耐寒優異等位變異及其相關的候選基因奠定重要基礎。

4 結論

本研究明確了83個切花菊品種的低溫半致死溫度(LT50)介于-10.99～1.86℃之間，變異系數達79.81%，通過聚類分析將其分為抗寒、中抗寒、低抗寒和不抗寒4種類型；檢測到8個抗寒有利位點，其中E7M12-13的表型效應值達到顯著水平(P＜0.01)，并篩選到攜帶該有利位點的6個抗寒品種。本研究結果為切花菊抗寒性的遺傳改良和分子標記輔助選擇育種提供了理論依據。