人心果不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

吳濤 張慧賢 張方州 鄭中兵

摘 要 以人心果果實為研究材料，以水、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯和石油醚共計5種溶劑對人心果果實部位進行提取，對5種提取劑提取的樣液分別進行DPPH自由基清除活性、鐵離子還原能力（FRAP）、ABTS自由基清除活性及總黃酮含量進行測定。結果表明，使用不同溶劑的人心果提取樣液測定結果中存有一定的差別，樣液抗氧化活性由高到低的排序為：70%乙醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚;此外，研究結果顯示，人心果的抗氧化活性與總黃酮含量存在較好的相關性。

關鍵詞 人心果;提取劑;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.066

人心果（Manilkara zapota）是山欖科人心果屬[1]，原產地在美洲熱帶，后又引種到印度和東南亞等地，我國人心果是由華僑從東南亞引種而來[2-3]。果樹屬于常綠喬木，具有白色乳汁，因其樹形美姿常用于觀賞領域;果實為漿果，成熟時呈灰褐色或銹褐色，果肉呈現黃褐色透明狀，果皮和果肉不易分離，有核[4-5]。人心果中含有大量的有益物質，何鋼等[6]發現人心果乳汁中具有多種對人體有益的化學成分，可進一步開發，作為多應用領域的植物。李安平等[7]發現人心果對于·OH、ABTS+、DPPH·的清除作用較好。張秀梅等[8]在人心果葉的研究中發現其抗氧化能力較好。馬飛躍等[9]在研究人心果葉片時發現，葉片中含有較高的抗氧化成分，同時采用多種方法測定人心果葉片抗氧化活性，發現結果存在差別。在實驗室測定水果抗氧化能力時，提取劑的選擇較為單一，類似研究也較為少見。然而想要全面客觀地反映某種水果的抗氧化活性必須設定在不同的反應條件中進行比較[10]，溶解水果成分的提取劑環境便是一個重要影響因素。

由于近年對人心果果實的研究相對較少，因此本研究選擇營養價值較高的熱帶名優水果——人心果。研究選取了甲醇、70%乙醇、水、乙酸乙酯和石油醚這5種較為常見的溶劑對人心果進行提取，并通過DPPH法、FRAP法、ABTS法分析樣液的抗氧化能力。3種抗氧化測定方法在國內食品抗氧化能力測定中很常見，且比較方便。此外，研究測定了人心果的總黃酮含量，并分析了其與抗氧化能力之間的相關性。

1 材料

1.1 實驗材料

人心果購自海口南北水果市場，經檢查確定新鮮且無病蟲害。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水溶性維生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、Folin-Ciocalteu、蘆丁。

1.3 儀器

KF10920單道可調移液槍、KD12283單道可調移液槍、AS220.R1萬分之一電子分析天平、粉碎機、T6新世紀紫外可見分光光度計、DHG-9053A干燥箱、HH-4A數顯恒溫水浴鍋、DW100實驗室超純水機、KQ5200E型超聲波清洗機、TGL-16S臺式高速冷凍離心機。

2 方法

2.1 樣液的提取

2.1.1 樣品的制備

將人心果洗凈后去皮切成片，放置在烘干箱中烘干，溫度為70 ℃，烘干時間約4 d。期間要保證烘干箱保持該狀態，切忌斷電。4 d后用粉碎機粉碎5 min，若仍存在顆粒大的樣品，可增加時長，或者用研缽將大顆粒研磨成粉末狀，在室溫下用保鮮袋保存。

2.1.2 稱量

使用分析天平稱取3組0.100 0 g樣品，并置于5 mL離心管中，標記序號。

2.1.3 樣液制備

使用無水乙醇配制70%乙醇，用移液槍吸取4 mL，加入離心管并充分振蕩。為了使水果的溶解更加充分徹底，將樣品進行超聲處理。超聲處理結束后將離心管擦拭干后離心，離心前要對每組進行稱量配平，達到每組盛有樣液的離心管質量一致的標準。配平后放入離心機，35 ℃條件下，5 000 r·min-1離心7 min。離心結束后，小心取出離心管，避免振蕩，將每個離心管上清液取出，按順序置于相應的10 mL離心管中。為了使樣品提取更加充分，向已提取上清液的5 mL離心管中加入3 mL70%乙醇，充分振蕩每個離心管后，進行第2次超聲離心，離心后合并兩次上清液并冷藏保存。用等體積蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚代替70%乙醇溶液按照同樣的操作步驟進行樣液制備。

2.2 DPPH自由基清除能力測定

依據Thaipong等[11]的方法，以Trolox作為標準樣品，做適當改進。取重量為0.062 6 g的Trolox標準品，使用70%乙醇溶液定容至25 mL，配制成濃度為10 mmol·L-1的Trolox乙醇溶液作為該實驗的母液。將母液按照表1進行濃度稀釋并編號。將標準溶液與2 mLDPPH甲醇溶液混合，充分搖勻后置入暗箱中，20 min后于517 nm處測量吸光值，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=-7 978x+2 738.7，R?=0.975 3）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應，于同等條件下測定不同提取液的DPPH自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定測定物質中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.3 FRAP法測定抗氧化能力

按照“2.2”配制Trolox母液并稀釋編號。取1 mL蒸餾水與10 μL標準溶液混合稀釋，搖勻后在體系中加入1.8 mL TPTZ溶液，混勻后在37 ℃反應10 min后于593 nm處測量吸光光度值，結果如表2所示，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=5 043x-457.59，R?=0.989 7）。

取10 μL樣品提取液，按照以上步驟反應，在相同條件下測定3個提取液的鐵離子還原能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定物質中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.4 ABTS自由基清除能力測定

依據于靖[12]的方法，配制Trolox母液并稀釋編號。取5 mLABTS溶液（7 mmol·L-1）和88 μL K2S2O8水溶液（140 mmol·L-1），避光反應12 h后于732 nm處測量吸光光度值，結果如表3所示，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=-4 730.9x+3 210.4，R?=0.988 8）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應，于同等條件下測定3個提取液的ABTS自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定物質中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.5 總黃酮測定

參照李洪芹[13]的總黃酮提取方法并加以改進，按照下表配制不同濃度蘆丁。取1 mL蘆丁溶液與0.15 mL的5% NaNO2混合，反應6 min;反應結束后繼續加入0.15 mL的10% AlCl3，反應6 min;再向體系中加入2 mL 4% NaOH及5 mL蒸餾水，反應15 min。在420 nm處測定吸光值，結果如表4所示，得到標準曲線（y=0.920 3x-0.000 1，R2=0.998 7）。

取1 mL樣液，按照以上步驟反應，于同等條件下測定3個提取液中的總黃酮含量，結果以蘆丁等價值g/100 g-1表示。

2.6 數據分析方法

采用IBM SPSS Statistics V21.0軟件進行數據分析，顯著性水平為0.05。

3 結果與分析

3.1 DPPH自由基清除能力

如圖1所示，人心果果實樣提取液具有一定的DPPH自由基清除能力，不同組別存在一定的差異。在清除能力上，乙酸乙酯提取液的抗氧化活性強度高于其余4種，水、石油醚、70%乙醇提取液測得的結果活性強度一般，甲醇測得的人心果抗氧化活性強度最差。

3.2 還原抗氧化能力（FRAP）

如圖2所示，在人心果的FRAP法測定抗氧化能力測定中，5種提取物均顯示出一定的還原能力，不同組別存在一定差異，提取劑分別為70%乙醇和甲醇的兩組還原抗氧化能力大致相同，明顯高于其他組，而提取劑為石油醚、乙酸乙酯時，還原抗氧化能力最弱。

3.3 ABTS自由基清除能力

圖3為ABTS法測定人心果樣液清除ABTS自由基的結果。不同組別存在一定差異，選用70%乙醇測得的活性強度最高，其次為水和甲醇，石油醚和乙酸乙酯的活性強度最弱。

3.4 總黃酮含量測定

從圖4可知，在人心果的總黃酮含量測定中，不同組別測定的含量存在一定差別。乙酸乙酯組測定的結果明顯較高，甲醇及70%乙醇的總黃酮含量一般且基本相同，含量最低的是石油醚和水。

3.5 相關性分析

通過表5可知，在0.05水平（單側）上，ABTS自由基清除法與FRAP法測得抗氧化活性強度呈顯著相關，使用DPPH法測得的活性強度結果與總黃酮含量相關。

3.6 Topsis綜合分析

為進一步綜合研究比較各種提取劑對人心果測定結果的影響，研究對測定的結果采用了Topsis綜合分析。

從表6中可得知，經過綜合分析比較，這5種溶劑中用70%乙醇提取人心果抗氧化活性物質效果最佳，其次是乙酸乙酯、甲醇和水，石油醚效果最差。

4 結論與討論

近年來，抗氧化活性研究在不同溶劑提取某種物質的相關研究中較為常見，牛德芳等[14]對油菜蜂花粉、蜂糧的水和醇提取物研究中發現，利用醇提取的蜂花粉和蜂糧測定結果比水好。趙玉紅等[15]用多種溶液對薔薇葉花青素、總黃酮、總酚進行提取并測定抗氧化活性，發現60%乙醇提取物的含量較高。田強等[16]對厚樸籽不同溶劑的萃取物進行比較分析，得到的結論是乙酸乙酯提取效果最好，與本實驗中通過Topsis分析后發現乙酸乙酯組的活性較強的結論類似。如果需要全面、科學地評價研究對象的抗氧化能力，應采用更合理科學的抗氧化活性測定方法進行測定，如ORAC法。ORAC法測量總體抗氧化能力，可以客觀地反映出即刻脂質過氧化程度[17]。

通過結果分析可知，提取劑的不同會影響到人心果抗氧化活性的測定結果，在這5種提取劑中，乙酸乙酯最適合用于DPPH法對人心果的測定，70%乙醇、甲醇適合用于FRAP法對人心果的測定，70%乙醇適合用于ABTS法對人心果的測定。通過綜合分析之后，70%乙醇是較適合人心果的提取劑。此外，從結果分析中可以知道DPPH法結果與總黃酮含量在0.05水平（單側）上相關，人心果的抗氧化能力與總黃酮含量也存在良好的相關性。

參考文獻：

[1] 楊威.人心果幾種主要病蟲害及其防治[J].現代園藝，2015（6）：60.

[2] 林更生.閩南的人心果[J].亞熱帶植物科學，1997，72（2）：12-17.

[3] 溫放，梁桂友，Hans.人心果[J].環球人文地理，2012（1）：157-157.

[4] 周開兵，陳夢暉.人心果栽培學要點總結及其在海南開發利用前景分析[J].中國農學通報，2006（3）：379-383.

[5] 張麗霞，楊坤，肖春芬.人心果的生物學特性及其栽培技術[J].中國南方果樹，2001（6）：37.

[6] 何鋼，文亞峰，毛紹名，等.人心果乳汁成分的定性分析[J].經濟林研究，2004（2）：38-41.

[7] 李安平，謝碧霞，王森，等.人心果、星蘋果和曼密蘋果抗氧化活性比較[J].園藝學報，2008（2）：175-180.

[8] 張秀梅，駱黨委，朱祝英，等.3種熱帶果樹葉子甲醇粗提物的抗氧化活性比較[J].核農學報，2015，29（1）：95-100.

[9] 馬飛躍，張秀梅，劉玉革，等.人心果葉片提取物抗氧化活性評價[J].中國南方果樹，2016，45（6）：79-82.

[10] 翁新楚，吳侯.抗氧化劑的抗氧化活性的測定方法及其評價[J].中國油脂，2000（6）：119-122.

[11] THAIPONG K，BOONPRAKOB U，CROSBY K，et al.Comparison of ABTS， DPPH， FRAP， and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts[J].Journal of Food Composition and Analyis，2006，19（6/7）：669-675.

[12] 于靖.杜仲種質資源及其果實質量評價[D].楊凌：西北農林科技大學，2015.

[13] 李洪芹.白花鬼針草總黃酮提取工藝研究[J].山東化工，2017，46（13）：30-32.

[14] 牛德芳，王波，張靜，等.油菜蜂花粉及其蜂糧不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2019，40（6）：42-46.

[15] 趙玉紅，師帥帥，張立鋼.‘魯赫刺薔薇葉不同溶劑提取物的活性成分及抗氧化性比較[J].現代食品科技，2019，35（5）：159-166.

[16] 田強，趙琳，羅毅沖，等.厚樸籽不同溶劑萃取物抗氧化活性比較分析[J].食品工業科技，2019，40（18）：54-58，64.

[17] 嚴歡，韓飛，李慕春.ORAC法對薰衣草非精油組分的抗氧化活性研究[J].食品科技，2018，43（12）：277-280.

（責任編輯：趙中正）