胞外肌動蛋白檢測的臨床應(yīng)用①

全紫瑤 吳兆立 謝圣高 崔天盆

(武漢市第一醫(yī)院檢驗科，武漢430022)

肌動蛋白存在于真核細(xì)胞中，作為微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，以兩種形式存在，即單體和多聚體。肌動蛋白單體是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱球狀肌動蛋白(Globular actin，G-actin)，球狀肌動蛋白在一定條件下聚合形成肌動蛋白絲，稱為絲狀或纖維狀肌動蛋白(Filamentous actin，F(xiàn)-actin) 。哺乳動物單體形式的肌動蛋白根據(jù)等電點的不同分為六種亞型：三種α-肌動蛋白，分布于各種肌細(xì)胞中，根據(jù)肌細(xì)胞特異性分為α-骨骼肌肌動蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、α-心肌肌動蛋白；兩種γ-肌動蛋白，包括只存在于平滑肌的γ-平滑肌肌動蛋白和存在于所有細(xì)胞胞漿中的γ-肌動蛋白；一種β-肌動蛋白，存在于所有細(xì)胞的胞漿中[1]。

胞內(nèi)肌動蛋白微絲系統(tǒng)參與各種細(xì)胞生命活動過程、如參與細(xì)胞形態(tài)維持及運動調(diào)節(jié)，確保了細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞與各種人造生物材料的相互作用。肌動蛋白細(xì)胞骨架在囊泡運輸、胞內(nèi)區(qū)室化及各種大分子在胞內(nèi)的定位過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。它存在于細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞為迅速溶解受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞而建立的免疫突觸囊泡中，影響溶菌性顆粒的釋放[3]。它的重構(gòu)及相應(yīng)的不同肌動蛋白亞型的表達與細(xì)胞分化的過程密切相關(guān)。在程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death,PCD)的不同階段中，也有著相當(dāng)明確且重要的作用，這種類型的PCD被稱為肌動蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2]。有研究表明肌動蛋白也可以存在于細(xì)胞核中，在染色體重構(gòu)、RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ轉(zhuǎn)錄及mRNA加工處理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞在血管中擴散遷移時，肌動蛋白有助于腫瘤細(xì)胞的存活，建立其與血液中的紅細(xì)胞和血小板的有效聯(lián)系，使其免于免疫系統(tǒng)的攻擊。同時，腫瘤細(xì)胞膜上侵襲性偽足中富含肌動蛋白，有助于其穿過血管壁和細(xì)胞外基質(zhì)外滲到新的部位，增加了腫瘤細(xì)胞的遷移潛力和侵襲性，可以作為觀察癌癥進展和評估治療的靶點[4]。

在細(xì)胞膜完整性受損的情況下，肌動蛋白被釋放到細(xì)胞外。在這種情況下，F(xiàn)-肌動蛋白就成為一種所謂的危險相關(guān)分子模式(Danger-associated molecular patterns,DAMPs)的一員，使機體“感受到危險”，并通過趨化和激活抗原遞呈細(xì)胞(APC)等免疫細(xì)胞增強固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前發(fā)現(xiàn)的警報素家族成員主要包括以下幾類：①抗菌肽(Antimicrobial peptides and proteins，AMPs)家族；②高遷移率族蛋白(High mobility group,HMG)；③IL-1家族；④熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)家族；⑤S100蛋白 (S100 proteins )家族；⑥三磷酸腺苷(ATP)嘌呤家族；⑦冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein,CIRP)。在沒有損傷和感染時，警報素發(fā)揮著重要的生理作用。在壓力和生理應(yīng)激、組織損傷、炎癥反應(yīng)時迅速釋放，激活和增強機體免疫防御系統(tǒng)[5]。

1 細(xì)胞膜外表面肌動蛋白與臨床

研究表明細(xì)胞膜外表面膜連肌動蛋白可參與多種生理與病理過程。有研究表明，精子頭部特別是位于精子赤道部和頂體部位的，膜表面可表達F-肌動蛋白能幫助精子進入卵細(xì)胞。精子發(fā)育成熟過程中細(xì)胞膜外表面發(fā)生肌動蛋白的聚合反應(yīng)，可能對受精過程至關(guān)重要[2，6]。但精子細(xì)胞不會受到機體免疫系統(tǒng)的攻擊，因為有血睪屏障的保護，睪丸組織可以隔絕免疫系統(tǒng)的相關(guān)組分，從而避免其針對F-肌動蛋白產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的可能[2]。

膜連肌動蛋白可以作為纖溶酶原結(jié)合位點，這對于纖溶系統(tǒng)來說，意義相當(dāng)重大。另外，脂蛋白a也能與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面肌動蛋白相互作用，并競爭性結(jié)合纖溶酶原的肌動蛋白結(jié)合位點，纖溶酶的產(chǎn)生因此而減少，導(dǎo)致纖溶活性減弱。含有兒茶酚胺的細(xì)胞膜表面的γ-肌動蛋白和β-肌動蛋白能與纖溶酶原結(jié)合，促進纖溶酶的生成，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[7]。內(nèi)皮細(xì)胞膜外表面膜連α-平滑肌肌動蛋白可作為血管生成素受體，從而誘導(dǎo)血管生成。在組織型纖溶酶原激活物(tPA)的作用下，血管生成素-肌動蛋白受體復(fù)合物同肌動蛋白一樣，可促進纖溶酶的產(chǎn)生。與肌動蛋白相比，血管生成素-肌動蛋白受體復(fù)合物并不會抑制纖溶酶活性[2]。 因此，在血管生成過程中，血管生成素促進了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使內(nèi)皮細(xì)胞能夠穿透基底膜并不斷延伸[8]。這種纖溶酶原激活機制可能也參與到某些病理過程中，乳腺癌患者癌組織中過量表達纖溶酶原激活級聯(lián)反應(yīng)中的一些組分，如尿激酶，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面產(chǎn)生大量的纖溶酶，促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移及擴散，對患者預(yù)后極為不利[7]。研究表明一些腫瘤細(xì)胞系(PC-3、HT1080及MDA-MB321)細(xì)胞膜表面表達的β-肌動蛋白，促進血管抑制素4.5的生成。血管抑制素4.5能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷徙延伸，并啟動其發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，抑制腫瘤新生血管的形成從而抑制腫瘤的進展。因此，腫瘤細(xì)胞膜表面β-肌動蛋白表達水平可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)[2]。

2 循環(huán)游離肌動蛋白與臨床

有研究表明，肌動蛋白可以進入循環(huán)系統(tǒng)如血液、腦脊液及其他生物體液，如淋巴液、尿液、支氣管肺泡灌洗液中,不僅可以作為細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，而且可能有直接的致死效應(yīng)。向大鼠血管內(nèi)注射G-肌動蛋白，其可在血管內(nèi)自我組裝聚合形成肌動蛋白微絲,導(dǎo)致微血栓的形成及內(nèi)皮損傷。與G-肌動蛋白相比，由于結(jié)合了ADP,F-肌動蛋白能夠激活血小板的聚集反應(yīng)，抑制了纖溶酶的活性，阻止纖維凝塊的溶解從而造成血栓。外源性肌動蛋白也可作為一種循環(huán)游離肌動蛋白，與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的肌動蛋白競爭性地結(jié)合血管生成素，從而抑制毛細(xì)血管的修復(fù)作用[2]。鑒于循環(huán)游離肌動蛋白的負(fù)面作用，血漿中也相應(yīng)存在胞外肌動蛋白隔離與清除系統(tǒng)，涉及凝溶膠蛋白(gelsolin)與族特異性成分球蛋白(Gc-globulin)的參與，后者又被稱為維生素D結(jié)合蛋白(vitamin D binding protein,DBP)，兩者共同作用將肌動蛋白從循環(huán)系統(tǒng)中清除。凝溶膠蛋白結(jié)合F-肌動蛋白并將其降解為G-肌動蛋白，Gc-globulin結(jié)合降解的單體G-肌動蛋白并加速其從循環(huán)系統(tǒng)中清除[9]。

2.1急性炎癥性疾病 心肌梗死患者，尤其是在急性前壁心肌梗死情況下，血液中α-肌動蛋白濃度水平可達到最高。Ⅱ型糖尿病及糖尿病腎病患者血清中高水平的α-肌動蛋白是患者發(fā)生急性心肌梗死或心絞痛的高危因素。另外，心絞痛患者根據(jù)布朗沃爾德分型標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)病情嚴(yán)重程度達到Class ⅢB時，患者血清中可檢測到高濃度的α-肌動蛋白[2]。壞死性小腸結(jié)腸炎患者血漿中α-肌動蛋白同樣也有升高，因此，α-肌動蛋白可用于小腸肌肉受損的診斷[10]。肝細(xì)胞壞死和膿毒性休克時，釋放入血液中的肌動蛋白含量與其致死效應(yīng)的相關(guān)性研究在臨床實踐中也有報道[9，11]。

急性肺損傷時，大量的肌動蛋白被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，外周血中可檢測到肌動蛋白/凝溶膠蛋白復(fù)合物[12]。重癥監(jiān)護室患者由于血漿凝溶膠蛋白水平下降，死亡率大大上升，住院時間及依賴呼吸機的時間都將延長。病情改善后，患者血漿凝溶膠蛋白水平上升[13]。經(jīng)過血液透析的患者，由于血漿中凝溶膠蛋白丟失，易患上全身性炎癥疾病，同時導(dǎo)致一年觀察期內(nèi)患者死亡概率增加[2]。

爆發(fā)性肝壞死患者血液中Gc-globulin水平降低，死亡患者更是如此，提示肝臟可能是機體產(chǎn)生該蛋白的主要器官。血清中Gc-globulin水平降低，肌動蛋白/Gc-globulin復(fù)合體濃度大大升高與急性肝衰竭患者的不良預(yù)后相關(guān)[2]。車禍或燒傷后持續(xù)處于高危狀態(tài)的患者，血漿中凝溶膠蛋白水平降低，導(dǎo)致患者死亡率升高[14]。

敗血癥及器官衰竭時，釋放入循環(huán)系統(tǒng)的肌動蛋白含量增多，清除系統(tǒng)的功能缺陷，血漿凝溶膠蛋白濃度水平降低，且濃度降低的程度與死亡率相關(guān),可導(dǎo)致相應(yīng)并發(fā)癥尤其是呼吸窘迫和血小板減少癥的發(fā)生[15]。膿毒性休克時Gc-globulin可以結(jié)合花生四烯酸，但當(dāng)Gc-globulin與肌動蛋白結(jié)合形成復(fù)合體時，其結(jié)合花生四烯酸的能力下降。肌動蛋白清除系統(tǒng)相關(guān)成分與肌動蛋白的結(jié)合也干擾了其與活性脂類物質(zhì)結(jié)合，從而阻止其發(fā)揮相應(yīng)的抗炎性免疫調(diào)節(jié)作用。血清中Gc-globulin水平顯著降低，而肌動蛋白/Gc-globulin復(fù)合體的百分比顯著升高，并且該復(fù)合體的濃度與疾病嚴(yán)重性及患者死亡率高度相關(guān)[2]。Sprague Dawley大鼠的腸系膜淋巴液中也存在肌動蛋白與凝溶膠蛋白，且其濃度與血漿中含量相當(dāng)[14]。出血性休克時，腸系膜淋巴液中的凝溶膠蛋白含量顯著降低。而該蛋白水平的下降又會導(dǎo)致促炎性脂類物質(zhì)的生物活性增強，造成肺及其他器官的毛細(xì)血管損傷[2]。

2.2慢性炎癥性疾病 在各種慢性炎癥疾病如多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)、老年癡呆癥(Alzheimer′s Disease，AD)、中風(fēng)(Ischemic stroke,IS)以及哮喘的不同活動期中，患者會出現(xiàn)低凝溶膠蛋白血癥[2]。多發(fā)性硬化-實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型血液中的凝溶膠蛋白濃度也降低[2，16]。中風(fēng)后患者的血漿凝溶膠蛋白含量也減少，并且該蛋白水平的下降發(fā)生在多器官衰竭之前[17]。哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中的凝溶膠蛋白表達也增強[2]。

神經(jīng)退行性病變患者腦脊液中的肌動蛋白水平較高，且其濃度變化與疾病進展相關(guān)。阿爾茲海默癥患者腦脊液中的凝溶膠蛋白可以結(jié)合β-淀粉樣蛋白，抑制β-淀粉樣蛋白的沉積并對其進行水解，而凝溶膠蛋白濃度顯著降低，升高的肌動蛋白水平可能會削弱凝溶膠蛋白的保護作用，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的進展[2]。

2.3自身免疫性疾病 細(xì)胞外肌動蛋白可作為自身抗原參與多種自身免疫性疾病的病理過程，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞膜表面檢測到特異性表達F-肌動蛋白識別受體——C型凝集素9家族A成員(C-type lectin domain family 9 member A,CLEC9A)，也稱為樹突狀細(xì)胞-NK細(xì)胞凝集素群受體1(DC-NK lectin group receptor-1,DNGR-1)，可誘發(fā)自身免疫性疾病[18]。研究表明，肌動蛋白與補體系統(tǒng)中C1q成分也有相互作用，肌動蛋白微絲可激活C1q，從而激活補體的級聯(lián)激活反應(yīng)，這一過程不需抗體的參與[2]。抗肌動蛋白抗體參與Ⅰ型自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展，血液中出現(xiàn)以F-肌動蛋白為特異性免疫球蛋白靶抗原是該病的一個重要的診斷標(biāo)準(zhǔn)，高滴度的抗肌動蛋白抗體往往伴隨有肝臟炎癥活動性指標(biāo)的升高,可作為疾病預(yù)后不良的標(biāo)志[19]。丙型病毒性肝炎患者血清中往往出現(xiàn)高滴度的抗F-肌動蛋白抗體，說明丙肝病毒可誘導(dǎo)機體對肝臟組織的自身免疫性攻擊反應(yīng)增強[20]。

肌動蛋白可作為一種自身抗原，誘導(dǎo)動脈粥樣硬化患者中的Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)生，參與該病各種系統(tǒng)性炎性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[21]。抗肌動蛋白抗體滴度水平，與動脈粥樣硬化過程中，頸動脈內(nèi)中膜厚度與外膜直徑的比值呈正比，即該抗體水平與腦血管意外事件的發(fā)生高度相關(guān)。急性冠脈綜合征患者血清中可出現(xiàn)抗肌動蛋白與抗肌球蛋白IgG抗體，抗體濃度越高，對心肌的損傷嚴(yán)重程度越重[2]。乳糜瀉患者體內(nèi)的抗肌動蛋白IgA抗體與小腸發(fā)生腸絨毛萎縮密切相關(guān)，且高滴度的抗肌動蛋白IgA抗體可作為小腸黏膜受損嚴(yán)重程度及腸絨毛萎縮病變的標(biāo)志物[22]。

IgA腎病患者血清中可檢出能與肌動蛋白結(jié)合的IgA抗體，原發(fā)性腎病綜合征患者血清中可出現(xiàn)抗肌動蛋白IgM抗體。自身免疫性內(nèi)耳疾病(如梅尼埃病、突發(fā)性耳聾、快速進行性感覺神經(jīng)性耳聾及耳硬化)以及肌萎縮側(cè)索硬化癥患者血清中可檢出抗β-肌動蛋白抗體[2]。

3 結(jié)語

綜上所述，肌動蛋白的功能不僅僅局限于其基本的生物學(xué)角色——作為細(xì)胞骨架的一種成分，肌動蛋白可也存在于細(xì)胞外環(huán)境中，不僅對細(xì)胞有直接的毒性作用，對凝血系統(tǒng)也有負(fù)面影響，而且削弱了肌動蛋白清除系統(tǒng)相關(guān)成分的抗炎性作用。另外，F(xiàn)-肌動蛋白可作為一種自身抗原，參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，疾病相關(guān)抗肌動蛋白抗體可作為多種疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物[2]。F-肌動蛋白介導(dǎo)多種病理生理過程與臨床疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，可以作為合適的分子標(biāo)記物，為疾病診斷提供可信賴的依據(jù)。進一步研究肌動蛋白在細(xì)胞外的存在形式，及其在生理與病理反應(yīng)過程中的作用，不僅僅對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，更是對許多重大疾病的診斷、預(yù)防及治療有重要意義。