同卵雙胞胎與B細(xì)胞的研究進(jìn)展①

董曉衡 蘇丹華 馬 龍 姚新生

(遵義醫(yī)學(xué)院，遵義563000)

1 同卵雙胞胎的基本生理簡(jiǎn)介

胎生動(dòng)物受精卵在從輸卵管向子宮移動(dòng)過程中會(huì)進(jìn)行有絲分裂形成兩個(gè)細(xì)胞，然后不斷進(jìn)行有絲分裂發(fā)育成胚胎。但是大多數(shù)情況下只會(huì)在子宮里形成一個(gè)胚胎,有時(shí)候也會(huì)形成一對(duì)胚胎即同卵雙胞胎，這也就導(dǎo)致了同卵雙胞胎具有相同的遺傳物質(zhì)。同卵雙胞胎的遺傳物質(zhì)雖然相同，但在表觀遺傳上卻存在差異，具有基因一致表型不一致這一特征，是研究人類遺傳、疾病等其他方面的理想材料[1]。

2 同卵雙胞胎與免疫相關(guān)疾病

2.1同卵雙胞胎與腫瘤 急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種起源于B系或T系淋巴祖細(xì)胞的腫瘤疾病，其發(fā)病起因與機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，以雙胞胎為研究對(duì)象更能清楚地表明遺傳因素對(duì)其發(fā)病的影響。2017年邱坤銀等[2]為了探討白血病發(fā)病病因，分析了一對(duì)同患ALL的同卵雙胞胎的病例并且從各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了同卵雙胞胎共患ALL的相關(guān)病歷資料。該對(duì)雙胞胎的發(fā)病時(shí)間前后相差四個(gè)月，分別標(biāo)號(hào)為雙胞胎A和雙胞胎B，他們的臨床分型結(jié)果為，雙胞胎A為高危型ALL，雙胞胎B為中危型；免疫分型均為普通B細(xì)胞性ALL。免疫球蛋白重鏈基因重排分析結(jié)果和白血病基因融合篩查結(jié)果均為陰性，但是染色體分型不一致。這一系列的結(jié)果表明該雙胞胎的發(fā)病原因可能是胚胎時(shí)期雙胞胎患兒之一存在白血病的胚胎期起源并通過胎盤傳遞給另一胎兒[3]。該團(tuán)隊(duì)對(duì)檢索收集到的同卵雙胞胎共患ALL的病例進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，若患病雙胞胎伴有混合譜系白血病(Mixed lineage leukemia，MLL)基因重排，則在治療后的隨訪未發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)跡象。這也就意味著MLL基因可能是白血病預(yù)后的重要因素[4,5]。Cazzaniga 等[6]曾對(duì)患ALL的兩對(duì)同卵雙胞胎的臨床表現(xiàn)和基因進(jìn)行了研究。臨床結(jié)果顯示雙胞胎1A在同種異體干細(xì)胞移植8年后身體狀況良好，但是雙胞胎1B在移植7個(gè)月后復(fù)發(fā)死亡；雙胞胎2A在同種異體干細(xì)胞移植后6個(gè)月后復(fù)發(fā)死亡，而雙胞胎2B身體狀況良好。基因結(jié)果顯示雙胞胎1A存在BCR-ABL1基因融合且PIK3AP1和DSCR5基因的缺失，雙胞胎1B同樣存在BCR-ABL1基因融合但是缺失的基因?yàn)镮KZF1。雙胞胎2A和2B都存在BCR-ABL1基因融合，雙胞胎1A檢測(cè)到IKZF1缺失，而雙胞胎2B沒有發(fā)生IKZF1的缺失。Cazzaniga 等[6]認(rèn)為BCR-ABL1基因融合可能是發(fā)生在胚胎時(shí)期，并通過胎盤克隆傳播，而IKZF1基因缺失是繼發(fā)性的，可能是出生后開始發(fā)生的[7]。在ALL中，IKZF1缺失應(yīng)該是BCR-ABL1(p190)的亞克隆，這可能是因?yàn)樵诼粤＜?xì)胞白血病中繼發(fā)于BCR-ABL1(p210)[8]。雙胞胎1A和1B治療方式相似，但結(jié)果卻非常不同，從而表明了KZF1缺失的存在似乎與不伴BCR-ABL1融合的B-前體ALL的不良預(yù)后相關(guān)[9]。基于雙胞胎的數(shù)據(jù)支持這樣的結(jié)論，即繼發(fā)性遺傳改變對(duì)于Ph+ALL的進(jìn)化是至關(guān)重要的，IKZF1基因的丟失可能大大加速了BCR-ABL1驅(qū)動(dòng)的白血病發(fā)生[10，11]。

2.2同卵雙胞胎與自身免疫病 為了鑒定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)患者的疾病特異性基因表達(dá)譜，Christian等[12]采集了11對(duì)RA不一致的同卵雙胞胎的外周血的類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系(Lymphoblastoid B cell lines，LCLs)并制備其cDNA。采用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)RA患者滑膜組織中選擇的基因產(chǎn)物和正常健康對(duì)照者的表達(dá)。結(jié)果顯示RA雙胞胎LCLs與健康雙胞胎LCLs相比，有1 163個(gè)轉(zhuǎn)錄本存在顯著差異表達(dá)，其中747例過表達(dá)，最顯著過表達(dá)的基因分別是laeverin、11β-羥基類固醇脫氫酶2型(HSD11B2)和富含半胱氨酸的血管生成誘導(dǎo)劑61(CYR61)。Christian等[13]研究結(jié)果表明laeverin是一種新發(fā)現(xiàn)的氨基肽酶，并在RA滑膜組織中大量表達(dá)。在此之前Fujiwara等研究發(fā)現(xiàn)laeverin基因在人絨毛外滋養(yǎng)層中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物與氨肽酶N(CD13)有著顯著的同源性，而氨肽酶N(CD13)在RA中發(fā)揮功能作用[14]，所以推測(cè)laeverin基因也可能也在RA中發(fā)揮著重要作用。基因HSD11B2的編碼產(chǎn)物11β-HSD2破壞了糖皮質(zhì)激素對(duì)骨質(zhì)的正向調(diào)節(jié)和負(fù)向調(diào)節(jié)的平衡，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[15]，這是RA關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)的常見表現(xiàn)。CYR61是一種成熟的血管生成因子，而RA血管發(fā)病機(jī)制的中心作用是血管生成[16]，Christian等認(rèn)為CYR61可能是罪魁禍?zhǔn)住Ｏ惹坝醒芯匡@示編碼Cyr61的基因在其他活性炎癥狀態(tài)如過氧化物肺損傷[17]或早期Graves眼病中過表達(dá)，Cyr61曾被提議作為疾病活性的標(biāo)志物[18]。在其他自身免疫病中，也有一些關(guān)于對(duì)同卵雙胞胎的報(bào)道，在一項(xiàng)關(guān)于重癥肌無力(MG)的研究中，Kakoulidou等[19]對(duì)同卵雙胞胎的抗體對(duì)疾病相關(guān)抗原和乙酰膽堿受體(AChR)的反應(yīng)性做了分析，以兩對(duì)同卵雙胞胎作為研究對(duì)象(每一對(duì)雙胞胎中，一個(gè)患病，另一個(gè)健康)，結(jié)果顯示兩對(duì)雙胞胎中的健康者和患病者都有血清抗體和B細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生疾病相關(guān)的自身抗體。健康雙胞胎和患病雙胞胎針對(duì)AChR的抗體血清濃度非常相似。外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的EBV轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體細(xì)胞的數(shù)目在雙胞胎內(nèi)也非常相似。這一結(jié)果表明健康雙胞胎對(duì)MG有抗自身抗體，并且也表明了在自身免疫中同卵雙胞胎具有類似的前B細(xì)胞庫(kù)。其他自身免疫性疾病也有類似的觀察結(jié)果出現(xiàn)，如在同卵雙胞胎中不同患橋本甲狀腺炎或萎縮性甲狀腺炎，健康雙胞胎的甲狀腺自身抗體水平也異常高[20]。

2.3其他疾病 常見變異型免疫缺陷病(Common variable immunodeficiency disease,CVID)是以B細(xì)胞功能喪失為特征的最常見的原發(fā)性免疫缺陷，部分取決于遺傳缺陷[21]，表觀遺傳學(xué)改變被認(rèn)為是其發(fā)病原因。Virginia等[22]用一對(duì)CVID不一致的同卵雙胞胎對(duì)該病癥進(jìn)行高通量的DNA甲基化分析，結(jié)果顯示與CVID相關(guān)的DNA甲基化有顯著變化，特別是B細(xì)胞相關(guān)基因的高甲基化，但這并不影響幼稚B細(xì)胞亞群。又進(jìn)一步對(duì)該雙胞胎分離的CD19+細(xì)胞進(jìn)行DNA甲基化篩選。其中雙胞胎CVID的患者缺少類別轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞，而他的健康同胞只呈現(xiàn)適度降低的IgA水平，IgG隨著年齡增長(zhǎng)至正常水平。通過進(jìn)行基因本體論(GO)分析和DNA甲基化數(shù)據(jù)與從CVID患者的B細(xì)胞獲得的現(xiàn)有基因表達(dá)數(shù)據(jù)與健康供體進(jìn)行比較[23]，從而得出在CVID B細(xì)胞中發(fā)生的甲基化改變可能影響相關(guān)基因的整體表達(dá)。通過一系列的調(diào)查研究Virginia等[22]認(rèn)為DNA甲基化與CVID的發(fā)生有關(guān)，但不能確定他們的因果關(guān)系。

3 同卵雙胞胎BCR CDR3組庫(kù)的特征及重排的可能機(jī)制

機(jī)體的體液免疫反應(yīng)主要由B細(xì)胞介導(dǎo)，其通過產(chǎn)生特異性抗體來應(yīng)答抗原，對(duì)機(jī)體起重要保護(hù)作用[24]。B 細(xì)胞識(shí)別抗原主要依靠其表面的BCR來完成，BCR CDR3是B細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵部位，也是最具有多樣性的。V基因、(D基因)以及J基因的隨機(jī)重排和V(D)J連接時(shí)中間插入的核苷酸數(shù)量不同導(dǎo)致了BCR CDR3的多樣性。B細(xì)胞在受到抗原刺激后發(fā)生二次重排以及二次重排后生發(fā)中心B細(xì)胞DNA的點(diǎn)突變進(jìn)一步豐富了BCR CDR3的多樣性[25]。

Rubelt等[26]通過高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing，HTS)分析了5對(duì)同卵雙胞胎的B細(xì)胞庫(kù)，并且開發(fā)了“庫(kù)相異度指數(shù)”(RDI)作為庫(kù)之間距離的量度。研究發(fā)現(xiàn)雙胞胎組的初始B細(xì)胞庫(kù)重鏈V和J基因RDI值低于非雙胞胎組，雙胞胎組的記憶B細(xì)胞庫(kù)重鏈V和 J基因RDI值同樣低于非雙胞胎組。Rubelt等[26]認(rèn)為初始細(xì)胞庫(kù)的差異影響記憶細(xì)胞庫(kù)的最終形成。為了闡明控制B細(xì)胞受體多樣性的遺傳機(jī)制的影響，Glanville等[27]對(duì)兩對(duì)同卵雙胞胎[雙胞胎A均健康，但生活環(huán)境不同；雙胞胎B1多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)，B2健康]進(jìn)行了高通量測(cè)序評(píng)估抗體庫(kù)的多樣性。結(jié)果表明重鏈V和D基因的取用在不相關(guān)的個(gè)體間有所不同，在雙胞胎之內(nèi)(A1與A2)高度相關(guān)，而重鏈J基因的取用無論個(gè)體間有沒有關(guān)系都沒有顯示出顯著的遺傳差異。盡管重鏈V和D基因的取用在雙胞胎之內(nèi)高度相關(guān)，但是觀察到相當(dāng)大比例的基因具有顯著不同的用途。Glanville等[27]又進(jìn)一步分析了來自經(jīng)歷抗原的類別轉(zhuǎn)換區(qū)重排的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三個(gè)健康雙胞胎(A1，A2，B2)中，類別轉(zhuǎn)換的重鏈V基因取用與它們各自的初始重鏈V基因概況顯著相關(guān)。即使變異增加，大部分片段在類別轉(zhuǎn)換和初始庫(kù)中出現(xiàn)頻率也相似。而在MS雙胞胎B1類別轉(zhuǎn)換的重鏈V基因的取用與初始重鏈V基因概況則大不相同。Glanville等[27]認(rèn)為同卵雙胞胎雖然擁有相同的基因，但在面對(duì)抗原刺激時(shí)雙胞胎之間也有可能產(chǎn)生不同的特異性抗體來應(yīng)對(duì)。在一項(xiàng)研究同卵雙胞胎B細(xì)胞庫(kù)對(duì)減毒活水痘-帶狀皰疹(VZV)疫苗接種的反應(yīng)中，雖然疫苗對(duì)集體產(chǎn)生了影響，但是雙胞胎在基因取用方面并沒有大幅度改變。Wang等[28]用減毒活VZV疫苗對(duì)四對(duì)同卵雙胞胎(雙胞胎A、B、C、D)進(jìn)行接種。又分別在疫苗接種當(dāng)天(接種前)和接種第8、14和28天采集外周血。在后續(xù)研究中分別做了VZV抗體效價(jià)的測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)分選漿母細(xì)胞，從PBMC中提取DNA和RNA，合成cDNA，PCR擴(kuò)增IGH并進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)雙胞胎的抗體庫(kù)在抗體重鏈V，D和J基因中具有高度相似性片段的取用，以及相似的CDR3的長(zhǎng)度和特征，這些相似性在雙胞胎表達(dá)IgM的B細(xì)胞庫(kù)中最為明顯，但在表達(dá)IgG的B細(xì)胞庫(kù)中不明顯。此外，雙胞胎在接種過程中IGHV、IGHD和IGHJ片段的取用頻率高度相關(guān)，這表明重鏈V、D、J片段的取用可能沒有被減毒活VZV疫苗影響，而在很大程度上和遺傳相關(guān)。

4 展望

同卵雙胞胎的B細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制很復(fù)雜，遺傳因素、環(huán)境因素在一定程度上均對(duì)B細(xì)胞的免疫應(yīng)答有影響。BCR是體液免疫應(yīng)答的重要分子，雙胞胎對(duì)相同疾病有不同反應(yīng)，這種現(xiàn)象是由基因、表觀遺傳還是環(huán)境因素導(dǎo)致的，具體機(jī)制尚不清楚。雙胞胎BCR在病理和生理狀態(tài)下是否存在某種聯(lián)系，另外遺傳因素對(duì)雙胞胎B細(xì)胞總記憶庫(kù)的影響尚未被研究，這一系列的問題需要更多的工作來確切地闡明。