光子晶體傳感技術在臨床快速檢測中的應用進展

徐天依 寧保安 劉穎

(1內蒙古醫科大學公共衛生學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2軍事科學院軍事醫學研究所環境醫學與作業醫學研究所)

目前，大部分臨床檢驗都需要經過專業培訓的工作人員使用專業儀器進行樣品采集，測試和分析。配備這些專業人員費用較高，并且檢測結果會受到由操作者錯誤造成系統誤差的影響。這些臨床實驗室檢測手段耗時，操作復雜，而且造價昂貴。因此，急需開發造價低廉，反應靈敏，快速，便攜式，無需標記和易于操作的醫療檢測工具。光子晶體(PC)是具有不同介電常數的周期性排列的材料，特殊的周期性的結構使它們具有很多獨特的光學性質。當PC結構受到外界的刺激而變化時，其產生的光學現象也會隨之改變。基于這一原理開發的PC傳感器具有許多超越現有的其他競爭型生物傳感技術的優點，比如制造方法簡單，成本經濟實惠和測定時間短。PC結構現已被用于檢測多種生物樣品中的生物標志物，如血液、尿液、汗液和眼淚等，其應用前景不可估量。

1 PC傳感技術簡介

PC結構是由介電材料在空間中周期性排列形成，這種特殊的結構會使電磁波受到入射光在介電邊界處反射的影響而不能傳播，即產生光子帶隙(PBG)，這也是PC材料最主要的光學特征〔1〕。在應用中，PC結構可以在一維(1-D)，二維(2-D)或三維(3-D)方向上制造，包括微腔，波導，平板，多層薄膜及多孔規則幾何形狀〔2～6〕。一維PC(1D-PC)結構最為簡單，其周期性僅存在于一個維度中，也被稱為布拉格反射器或布拉格反射堆，它們只能特定地反射一種波長，通常通過逐層沉積，多次旋涂或光刻等技術來制備〔7〕。二維PC(2D-PC)結構的特征為其在兩個空間方向上的周期性，主要通過復雜的自上而下方法制造，例如納米壓印光刻和電化學蝕刻技術等〔8〕。盡管2D-PC的溝槽和多孔結構為生物化學相互作用提供了更高的表面積，但當應用于臨床樣品時較大的生物分子(例如細胞)可能會在通道內聚集，甚至導致阻塞。三維PC(3D-PC)結構在立體三維中具有周期性。常見的3D-PC結構例如蛋白石PC和反蛋白石PC，這種稱謂源于自然界中一類存在三維周期性結構的礦石，其表面十分光滑且具有炫目的虹彩色。制備3D-PC的方法有很多，其中化學自下而上的方法相對而言更經濟簡便，主要是通過納米級的單分散微球進行自組裝來構成PC主體，自組裝法是利用了顆粒間相互作用的特性，例如靜電斥力、磁力、慣性力和毛細現象等〔9〕。微球取材廣泛，可以選擇二氧化硅、氧化鋅、二氧化鈦或有機聚合物如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等〔10〕。3D-PC陣列是由存在于空氣或溶劑等電介質中的電介質微球構成。將布拉格定律與Snell折射定律相結合可以發現，如果反射波長受化學或生物相互作用的刺激而改變，會使PC結構發生一系列光學現象變化，可以應用于傳感檢測〔11〕。微球中心距離和介質折射率是兩個可導致反射波長變化的變量。兩者經常同時變化，其中改變晶格間距通常更為容易，但利用折射率變化或單個光子晶體改變的傳感器則具有更高的靈敏度和更快的響應時間，例如在PC中引入水凝膠制作反蛋白石PC〔12〕。PC表面受外部刺激引起有效折射率的變化，從而使共振波長峰值發生偏移，其偏移量可用于評價生物化學作用的情況。 目前PC結構在開發生物化學傳感器領域已經獲得了極大的關注，已被廣泛應用于捕獲，檢測和量化各種生物分子，如病原體、核酸、蛋白質、酶、葡萄糖、細胞和癌癥生物標志物等〔13～19〕。

2 PC傳感技術在臨床檢測中的應用進展

2.11D-PC 1D-PC主要由材質不同的兩種薄膜交替排列而成，由于其與光發生鏡面反射，因此制作中不宜選用對光吸收較強和散射作用較大的材料。Bouzidi等〔20〕提出了一種基于1D-PC結構的生物傳感器，用于監測血糖。該研究將1D-PC中兩種材料的交替層中間的空層注滿血液，血液層導致透射光PBG內出現電磁模式，其頻率取決于血液中葡萄糖的濃度，進而達到了檢測的目的。Sinibaldi等〔21〕報道了使用一種利用1D-PC與外部均勻介質之間的布洛赫表面波，結合熒光檢測的光學平臺，可對細胞裂解液中乳腺癌生物標志物ERBB2臨床相關濃度進行檢測，檢測限為0.3 ng/ml(1.5 pmol/L)。另外Rizzo等〔22〕利用Bloch表面波特性設計了一種新型集成生物傳感平臺。作者將1D-PC直接沉積在低成本的一次性塑料生物芯片上，使用夾心免疫測定法檢測緩沖液、細胞上清液和人血漿中的血管內皮生長因子(VEGF)，該平臺在人血漿樣品中檢測到低至3.5 ng/ml的VEGF，且分辨率高，檢測速度快(30 min)，并且與酶聯免疫吸附測定結果非常一致。但1D-PC的結構相對簡單，大部分情況下只作為傳感元件，具體檢測還需要依賴一些外部設備，如熒光檢測等，這也限制了它在臨床檢測中的應用。

2.22D-PC材料 2D-PC的制造方式有很多，其中納米壓印光刻(NIL)是一種快速，簡單且可擴展的圖案轉移技術，可替代需要昂貴設備和復雜操作的電子束光刻。在NIL方法中，首先在母模上使用深紫外或電子束光刻生成圖案，然后可以輕松地將其轉移到復制品上。Endo等〔23〕成功通過NIL技術制造了2D-PC聚合物，并將慢性阻塞性肺病(COPD)的生物標志物纖維蛋白原的抗原修飾在其表面，利用抗原-抗體的高靈敏度反應，使PC的衍射峰發生紅移，即可在1 h內有效地無標記檢測纖維蛋白原，檢測限為100 pg/ml。另有Su等〔24〕根據涂覆金的2D-PC上局域表面等離子體共振(LSPR)的變化實現對載脂蛋白E4基因序列相關DNA的檢測。這項研究中，作者使用了NIL方法在柔性共聚物膜上制造2D-PC結構，證明其具有制作應用于診斷方面的小型化和可穿戴式生物傳感器的前景。目前NIL方法已被用于快速可靠地批量生產PC結構，然而由于磨損，單個模具可制備的復制品數量有限，模具的使用壽命也較短〔8〕。2D-PC結構也可以與水凝膠結合制作傳感器，其優勢在于①2D陣列和水凝膠可獨立制造，2D陣列可以在聚合過程中附著在水凝膠表面上或嵌入水凝膠中;②傳感器的響應可以通過測量德拜環而不是使用光譜儀來確定;③2D-PC傳感器的讀數是可靠的，因為來自2D材料的衍射光與折射率無關。高敏君等〔25〕將分子印跡技術與2D-PC水凝膠結合起來，制備了一種特異性檢測紅霉素的PC傳感器，通過測量由于單色光垂直射入2D-PC結構而產生的德拜環的變化，來反映紅霉素的濃度。另有一項研究，Chen等〔26〕提出了一種新型的凝膠化單層膠體晶體PC材料，用于監測淚液中的葡萄糖。研究者將二維組裝的微球膠體包埋在4-硼苯甲醛修飾的聚乙烯醇(PVA)水凝膠中。當葡萄糖分子與硼酸鹽結合時，PVA和硼酸根離子的比例發生變化，導致水凝膠體積改變，伴隨著結構色明顯轉變。在180 s內，葡萄糖濃度從0變化到20 mmol/L，其結構顏色可以從紅色變為黃色再變為綠色。作者進一步檢測了眼淚中葡萄糖濃度，證明該傳感器具有高精度和高靈敏度特征，這種智能傳感材為進一步開發例如用于葡萄糖點監測的隱形眼鏡等可穿戴醫療器材提供了一定的可能性。

2.33D-PC 3D-PC可分為孔洞型和非孔洞型材料，孔洞型材料主要指3D有序的多空穴材料，是指向堆壘好的膠體PC中灌入交聯劑，通過紫外光照射等手段使交聯劑發生交聯，形成網絡結構，再通過腐蝕或煅燒手段將膠體顆粒除去，形成具有有序結構的大孔材料。非孔洞型材料是指單分散的膠體顆粒在介質中周期性排列形成的PC結構。介質為空氣時形成的結構稱為膠體晶體，介質為單體水凝膠交聯聚合時形成的結構稱為膠體晶體有序陣列(PCCA)。Wu等〔27〕提出了一種蛋白石PC傳感材料，可以無標記檢測轉鐵蛋白(TRF)。由甲基丙烯酸甲酯和3-丙烯酰胺基苯基硼酸聚合而成的單分散微球，通過垂直沉降自組裝，堆壘成PC，利用TRF與微球上硼酸基團的反應，制備成對TRF特異性響應的PC傳感器，隨著TRF濃度增加，衍射峰強度降低。TRF的檢測限為2×10-3～200 ng/ml，并進行了模擬尿樣中TRF濃度的測量，為臨床診斷中的TRF測定提供了廉價且易于使用的替代方案。Elsherif等〔28〕將微工程光學漫射器結構壓印在苯基硼酸官能化水凝膠薄膜中，漫射器使入射光聚焦在不同焦距和方向上，從而在透射和反射模式中讀出漫射的光分布。由于苯硼酸可以可逆地與葡萄糖分子的順式二醇結合，使水凝膠體積膨脹，改變其陣列原有秩序，進而改變水凝膠薄膜的焦距，因此可以測量通過傳感器的透射光學光傳播和強度，以確定生理條件下葡萄糖濃度的變化。作者將這種傳感器集成在隱形眼鏡中并放置在人造眼睛上。人工刺激葡萄糖濃度的變化可以使用智能手機的光電二極管進行定量測量。利用智能手機app將接收光強度轉換為定量葡萄糖濃度值。這種檢測方案可以設置在可穿戴實時生物標志物監測設備中以供護理點使用。Lee等〔29〕制備了基于SiO2的反蛋白石PC結構作為生物傳感器。作者使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，琥珀酰亞胺基-N-馬來酰亞胺基丙酰胺基-四乙二醇酯作為交聯劑制備了反蛋白石PC結構，然后利用蛋白G將抗體固定在其表面來捕獲流感病毒。由于抗體抗原特異性結合造成有序大孔材料結構變化導致衍射峰的紅移，可以通過監測反射光譜來無標記檢測流感病毒。該材料在噬斑103～105單位(PFU)范圍內顯示出高靈敏度，并且對甲型H1N1流感病毒具有高度特異性。另外3D有序孔洞型材料還可以與記憶材料結合，通過多空穴的塌陷和復位來可逆的檢測氣體中的丙酮〔30〕，由于糖尿病患者呼吸中含有丙酮，該技術有望應用于糖尿病酮癥酸中毒的監測。

3 結 語

臨床上對生物分子的檢測面臨多重挑戰，包括缺乏集中化實驗室，技術能力有限，缺乏熟練員工及醫療保健管理系統較差(特別是在資源有限的環境中)等問題。基于PC的生物傳感器代表了一類先進的新型光學生化傳感器，可以一定程度上解決這些難題。PC材料可以通過簡單的手段，使用便宜的原料如金屬、氧化物、塑料、聚合物和玻璃等來大量生產。最近，PC結構已經與智能手機，柔性材料和可穿戴傳感器等新興技術相結合，這更提高了它作為診斷工具的利用率。但臨床樣品中通常包含細胞和組織等復雜的生物流體，這些可能干擾PC傳感器的換能過程，并且一些PC結構目前只做到了定性檢測，還需研發更精確的讀出系統。雖然仍有很多難關尚未攻克，但PC材料應用于臨床檢測的前景不容小覷，這需要我們繼續努力，開發出更加方便快捷，經濟實用的臨床醫療檢測設備。