神經干細胞移植治療阿爾茨海默病的研究進展

朱清 陳艷 胡楠 高漢雄 姜榮榮

(廣州醫科大學附屬第二醫院康復醫學科，廣東 廣州 511436)

阿爾茨海默病(AD)是一個多病因的神經退行性疾病，炎癥與氧化應激，代謝障礙，鈣離子通道受損，線粒體障礙，神經營養因子(NT)缺乏等都與AD的發生密切相關〔1，2〕，這些病因導致了AD的治療缺乏特異性。神經元的損傷和丟失是大多數神經退行性疾病的共同的最后通路，AD復雜的病理改變，最終導致膽堿能神經元損傷和丟失，引起學習記憶障礙。目前臨床上AD的治療如藥物治療、基因治療、康復訓練等〔3〕只能改善癥狀，并不能阻止疾病的進展。近年來，神經再生理論的發展和干細胞體外分離及培養的成功，為神經退行性疾病的治療提供了一個嶄新的視野，尤其是神經干細胞(NSCs)在AD的治療上發揮了關鍵的作用。細胞移植治療可以從根本上解決AD神經細胞丟失的問題。本文從治療AD的干細胞種類、NSCs移植治療AD、NSCs聯合神經生長因子(NGF)移植治療AD三個方面展開綜述。

1 干細胞治療AD的基礎

1.1胚胎干細胞(ESCs) ESCs來自囊胚期(胚胎5～6 d)內細胞團，能夠向內、中、外三胚層細胞分化，理論上，ESCs可以誘導分化為機體內所有類型的細胞〔4〕。ESCs分化與微環境密切相關，研究提示，ESCs作為一種更“原始”的全能干細胞，具有分化多樣性的同時也存在分化難調控性，其在體內難以定向分化為功能性神經細胞，細胞增殖失控和腫瘤形成限制了ESCs在體應用〔5〕。研究者們致力于研究一種簡單卻行之有效的方法，即將ESCs體外預先分化為神經前體細胞/神經元，再進行在體移植，結果顯示，各種AD動物模型的認知功能均有一定程度的恢復，未見腫瘤形成〔6～8〕。盡管ESCs的前臨床實驗已經開展，但是，ESCs潛在的免疫排斥反應及來源限制仍然是阻礙ESCs應用的關鍵。

1.2間充質干細胞(MSCs) MSCs包括骨髓、脂肪組織、滑膜、臍帶、胎血、肺、肝臟等〔9〕。MSCs因無倫理限制和免疫排斥反應，比ESCs略占優勢。在目前的研究中，MSCs中又以骨髓MSCs(BMSCs)和從人胎盤及其附屬物中分離得到的包括羊膜MSCs(AM-MSCs)、臍帶MSCs(UC-MSCs)等研究的最為深入。在特定條件下，MSCs可以分化為不同組織類型的細胞，例如骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞等。Lee等〔10〕將骨髓來源的MSCs 移植入淀粉樣前體蛋白/早老素(APP/PS)1小鼠海馬中，結果顯示BMSCs移植能夠明顯激活小膠質細胞，緩解Aβ負荷，與此同時降低Tau蛋白過度磷酸化，移植之后小鼠的學習記憶能力明顯改善。Zheng等〔11〕做了類似研究，將人AM-MSCs海馬移植轉基因小鼠，結果顯示AM-MSCs 移植使神經發生增強，突觸密度增加；與此同時，AM-MSCs 移植調節腦內炎癥環境，促進小膠質細胞吞噬功能，減少Aβ水平，最終學習記憶功能顯著改善。不同來源的MSCs在治療神經退行性疾病方面具有廣闊的前景，雖然MSCs誘導產生效應的機制尚不完全清楚，已經證實MSCs可促進神經發生，刺激血管生成，抗凋亡及調節免疫反應等〔12〕。國外學者開展了臨床Ⅰ期的實驗，將人臍帶血間充質干細胞(hUCB-MSCs)移植到AD患者雙側海馬和一側楔前葉(低劑量3.0×106個細胞和高劑量6.0×106個細胞)，事實證明，干細胞移植是安全可行的方法，9名受試者未發生干細胞相關的不良反應，在后期兩年隨訪實驗中，未見腦出血、腫瘤形成及其他生理生化指標異常。但是，hUCB-MSCs移植并沒有改善β淀粉樣蛋白(Aβ)負荷，與動物實驗結果相悖。研究者認為，出現這一現象與檢查指標的方式、腦內微環境、移植物的來源甚至與物種發展有關，即低級物種接受高級物種干細胞移植將會受益更多〔13〕。目前，MSCs在腦脊髓損傷、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、帕金森病(PD)的臨床實驗已經陸續開展。

1.3誘導性多能干細胞(iPSCs) iPSCs最初由國外兩學者Takahashi和Yamanaka提出并命名，其原理是將已分化的體細胞經過特殊基因重編程恢復到未分化原始水平，使其具有干細胞的基本特性〔14〕。iPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，可從患者自身取材，不存在免疫排斥、倫理等問題，為干細胞治療帶來了新的希望。近十年來，iPSCs在各領域研究頗多，由iPSCs來源的細胞在神經科學領域如AD,PD及ALS等疾病的治療方面取得了較滿意的成績。Fujiwara等〔15〕將人iPSCs體外誘導分化為膽堿能表型的神經元細胞，將此種細胞移植PD APP小鼠(一種年齡依賴性Aβ沉積和漸進性認知障礙的轉基因鼠)雙側海馬，結果顯示移植的細胞存活，并能分化為膽堿乙酰轉移酶(ChAT)陽性神經元及γ-氨基丁酸(GABA)能神經元，細胞移植組小鼠的空間記憶能力明顯提高。除了細胞移植外，iPSCs在人類疾病模型和藥物監測方面也具有極大的發揮空間〔16〕。但是iPSCs用于臨床仍然存在一些亟待解決的問題，比如iPSCs誘導率比較低下及潛在的腫瘤風險。雖然iPSCs是從患者自身體細胞重編程而來，但仍有報道稱iPSCs來源的細胞存在免疫原性，這可能與iPSCs來源的某些終末分化的細胞類型有關〔5〕。

1.4NSCs NSCs主要來自胚胎或胎兒神經組織，現已發現成年哺乳動物大腦中也存在大量NSCs。NSCs具有很強的自我更新及多向分化潛能，能夠分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。近二十年來，NSCs成功的體外培養為神經退行性疾病的細胞治療帶來了希望，相對于ESCs、iPSCs、MSCs來說，NSCs作為神經祖細胞，具有更小的導致腫瘤的可能性及免疫原性。基底前腦膽堿能功能障礙，導致投射入海馬和皮層的膽堿能神經元減少，而這些區域神經元損傷或丟失是引起AD認知功能障礙的根本原因。在這種情況下，外源性NSCs的輸入顯得尤為重要，可以直接替代腦內丟失或損傷的神經元，此外還可以分泌NT，抗炎癥反應和減輕Aβ負荷，發揮神經保護作用，改善認知功能。目前，NSCs在ALS、腦卒中、癲癇的試驗性治療已經開展，并且植入物未引起中樞體液免疫反應。盡管NSCs治療AD在動物實驗中有較多的成功案例，但臨床應用目前依然處于探索階段。

2 NSCs移植治療AD

2.1AD與NSCs發生 側腦室室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)存在神經發生，在神經發生損傷時，此處的NSCs可以增殖并分化為神經元和膠質細胞，遷移至大腦適當的區域并整合入宿主神經系統，修復神經回路。神經發生受內外在因素的調控，在適應性反應、學習記憶過程、腦損傷修復中發揮重要作用〔17〕。研究表明，神經發生的損害能夠引起嚙齒動物學習、記憶等認知功能障礙。但是在AD腦內，神經發生是增加還是減少仍飽受爭議。一些研究證實，在轉基因AD模型鼠中，神經干/前體細胞(NS/PCs)的增殖和存活明顯減弱，分化能力降低，可補充的神經元大量減少及凋亡增加，這種現象與Aβ有關。研究發現，AD腦組織中Aβ沉積可中斷神經發生，并對外源性NSCs的存活、增殖有明顯抑制作用，Aβ對NSCs的抑制可能與鈣超載及激活胱門蛋白酶(caspases)有關〔18,19〕。體外研究得到了同樣的結果，Aβ42通過激活caspase信號通路促進人NPCs凋亡。有趣的是，有研究者對AD動物模型和AD患者尸檢發現，海馬DG和CA1區神經發生增加〔20〕，這與Jin等〔21〕研究結果類似，即AD患者海馬區NSCs的數量和未成熟神經元標志蛋白的表達增加，但成熟神經元標志蛋白沒有增加。Li等〔22〕同樣發現AD患者DG區未成熟神經元標志蛋白輕微減少，成熟神經元標志蛋白明顯減少。這些結果表明，AD中神經發生是增加還是減少，目前出現兩種不同的結論，出現這種結果的原因可能與選擇神經元的標志物、檢測的手段、AD動物模型及疾病所處不同年齡階段均有關系。但是，AD中內源性神經再生增加有可能僅僅是大量神經元破壞情況下的一種代償反應，而損害的神經元刺激的神經再生往往不能達到滿意的修復效果。最終趨于一致的結論是：AD中成熟的神經元減少，不能完成相應的信號傳導，導致學習和記憶障礙。

2.2外源性NSCs與AD 內源性神經再生損害或神經再生不足導致功能性神經元減少，最終引起AD認知功能受損。NSCs移植緩解AD模型鼠的學習記憶障礙，一方面移植的NSCs存活、遷移、并分化為神經元，補充丟失的神經細胞；另一方面移植的NSCs分泌NT，保護移植細胞的存活，并部分改善AD腦內的病理微環境，促進內源性NSCs激活〔23,24〕。盡管干細胞治療在哺乳動物中有較多的證據，但是干細胞治療AD的臨床試驗寥寥可數。

細胞移植治療可以從根本上解決AD中神經細胞丟失的問題，其可能的機制為:①替換損傷和丟失的神經細胞，干細胞可分化為膽堿能神經元，與宿主整合，修復神經通路，直接替代丟失的神經元，是能夠治愈神經退行性疾病的根本原因；②分泌營養因子，干細胞可分泌神經營養因子如NGF、腦源性神經營養因子(BDNF)、NT-3等促進細胞存活，增加突觸連接，改善認知功能；③抗淀粉樣蛋白生成，干細胞移植減少Aβ水平，減輕Aβ毒性反應，有利于移植細胞存活及認知恢復；④抗炎癥反應，干細胞移植減少促炎因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達，發揮神經保護作用；⑤促進內源性NSCs激活，外源性NSCs移植改善腦內微環境，有利于內源性NSCs存活并刺激其激活；⑥提高腦內神經元代謝活動，干細胞移植增加神經元之間連接及代謝，改善認知功能〔25,26〕。

大量研究表明，將NSCs移植到腦內，移植的NSCs可在體內存活、遷移并分化為功能性神經元，整合入宿主神經回路，修復神經功能。Ager等〔27〕將人NSCs移植到3xTg-AD模型鼠海馬中發現，移植的NSCs存活、集中在海馬CA1區周圍，并廣泛遷移至胼胝體，移植6 w后仍然有將近40%細胞存活。移植的NSCs能夠分化神經元，但分化緩慢，2 w后仍有大量干細胞標志物表達；AD小鼠學習記憶功能改善可能與神經連接增強和神經元代謝活動提高有關〔25〕。NSCs的分化與腦內微環境有關，而且，單純NSCs移植入腦內，此分化條件無法掌控，對膽堿能神經元的補充有限。據此，一些學者在體外將NSCs分化為膽堿能樣神經元，再進行腦內移植。結果表明，3個月后移植的膽堿能樣神經元在體內近82%分化為膽堿能神經元，與對照組相比，實驗組能夠明顯改善學習記憶能力及突觸功能。移植前誘導分化為膽堿能樣神經元能夠更好地解決AD中膽堿能功能的退化〔28〕，但是，神經干細胞作為神經系統的“祖”細胞，屬于未分化的原始細胞，移植后不容易發生異體排斥反應，若在體外分化為神經元再進行移植，可能會增加免疫源性，不利于其存活；其次，已分化的細胞遷移性差，使治療相對局限，不利于廣泛性腦內病變的治療。

3 神經干細胞聯合神經營養因子移植

誘導移植的NSCs分化為膽堿能神經元以補充丟失和損傷神經元是目前AD治療研究的熱點。大量研究表明，NT可影響正常神經干細胞甚至AD中異常神經干細胞的存活、增殖和分化〔29〕。例如，NGF、BDNF、NT-3均可促進外源性NSC存活、增殖和分化。改變NSCs的因子微環境對NSC的激活發揮治療作用極其重要。

3.1NGF NGF在1950年初次發現，之后，研究者們對NGF誘導干細胞分化為神經元及NGF的神經保護作用做了大量的體外及在體實驗研究。體外研究表明，NGF可促進NSCs分化為膽堿能神經元，且不分種屬來源，并且ChAT的活性及水平呈現劑量依賴式提高〔30，31〕。NGF除了誘導干細胞分化外，還可以與其功能性受體TrKA和P75結合，防止細胞核和線粒體程序性死亡起到神經保護作用〔32〕。有趣的是，在AD動物模型中也發現了成熟NGF減少，一些研究表示，NGF的慢性消耗促進了AD樣神經退行性疾病發生，包括神經元丟失、膽堿能損害、tau蛋白磷酸化、Aβ斑塊聚集等，而這些病理反應又導致了NGF水平下調〔33〕，NGF水平下降成為了這一惡性循環的重要中間環節。NGF因其誘導NSCs分化、保護膽堿能神經元、增加突觸功能、逆轉細胞外Aβ的沉積及改善認知的作用〔34〕，在治療神經退行性疾病領域的優越性日漸凸顯。一項為期10年臨床治療從2001年3月到2011年10月，10個早期AD患者接受了NGF基因治療，研究顯示，退化的神經元可對NGF做出反應，具體表現為軸突出芽和細胞肥大；并且相關的細胞信號被激活〔35〕。不管是體外還是在體實驗中，NGF都顯示了舉足輕重的治療作用。

3.2NGF聯合NSCs治療AD 單純NSCs移植存在移植細胞存活率低、分化為神經元數量少等問題。NGF具有神經保護和促進膽堿能分化的作用，NGF與NSC聯合移植治療AD可促進神經元的存活和分化，同時還可促進內源性NSCs的激活。但是，NGF應用也有相應的局限性，一方面，NGF作為一種大分子蛋白質，難以透過血腦屏障(BBB)，不利于腦靶向給藥；其次，NGF半衰期短，腦內注射很快被稀釋和代謝，若反復注射會增加顱內感染的概率并誘發疼痛，這些都限制了NGF的應用。為了提高NGF的生物利用度，研究者們致力于研究一種緩釋的、可控的安全有效的NGF藥物遞送系統(DDS)-NGF納米遞釋系統。

NGF納米遞釋系統能以一種安全有效的方式在腦內達到緩釋效果，比鼻內注射或側腦室注射更能充分利用NGF，并能減少相應的副作用。脂質體、聚合物膠束、納米粒是目前最常用納米遞釋系統。

研究發現腦靶向分子乳鐵蛋白修飾的NGF脂質體能夠透過人腦微血管內皮，并且能保護Aβ42誘導的SK-N-MC細胞損傷；但是體外釋放的研究發現在最初的48 h內，釋放總量可達到72%～90%〔36〕。轉鐵蛋白結合的脂質體可以提高齲齒動物腦內NGF基因表達，促進腦損傷的修復〔37〕。修飾的脂質體除了用于治療外，還可以用于疾病的診斷，例如有研究者將PEG修飾的脂質體形成的隱形脂質體能夠識別AD中淀粉樣蛋白靶向分子，靜脈注射APP/PS1小鼠后，脂質體透過BBB，并結合淀粉樣斑塊，實現對AD的診斷〔38〕。脂質體作為遞釋載體的給藥系統需要解決其載藥量的問題；另外，脂質體的穩定性及長循環的特性也是影響遞送效率的關鍵。聚合物膠束是由PEG提供親水的外殼，聚合物PLA、PLGA、PPO或者PCL組成疏水的內核〔34〕。膠束的親水性外殼可逃避免疫系統的清除，疏水性內核可以包載疏水性或難溶性藥物,提高藥物的穩定性。但包載NGF膠束的研究少有報道。

聚合物納米粒是將藥物包載于以高分子聚合物為載體材料的骨架中或吸附在其表面而形成，因其控釋和緩釋的作用，是目前研究最多的藥物遞釋系統。包載藥物的聚合物載體材料包括殼聚糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)、聚己丙酯(PCL)、α-聚氰基丙烯正丁酯(PBCA)等，其中PLGA已經被美國食品藥品監督管理局(FDA) 批準用于組織工程和藥物載體的應用。體外研究表明，神經生長因子納米粒(NGF-NP)具有毒性低、生物相容性高、緩釋特性，可促進PC12細胞及BMSCs存活、增殖和分化〔39，40〕。有研究將PEG-PLGA作為載體，包載NGF制備NGF-NP，其在體外可持續釋放NGF，56 d累積釋放60%左右。體外實驗發現NGF-NP可促進神經干細胞存活、增殖和分化。將這種納米粒聯合NSC移植治療AD模型大鼠，結果表明，與單純NSC移植相比，聯合移植組學習記憶能力改善更好，并且基底前腦膽堿能神經元，海馬突觸數量明顯增加〔41，42〕。

這些結果提示，NGF納米遞送系統是目前彌補NGF在體內應用不足的關鍵治療策略。其所用的載體材料與制備工藝是影響NGF載藥量及遞送效率的關鍵，目前，在所有的遞送系統中納米粒因其控釋、緩釋，安全穩定，穿透血腦屏障及細胞和組織相容性等優點，成為研究最多的遞釋系統。研究表明，NGF-NP在體外能持續釋放NGF，釋放的NGF與包載前具有同樣的理化性質，能夠促進干細胞存活、增殖和分化。因此，NGF-NP聯合NSC移植治療中樞神經系統退行性疾病可起到多重作用，持續釋放的NGF可以補充內源性NT的不足，修復損傷的神經細胞；同時可促進內源性及外源性NSC分化為神經元。

4 NSCs相關基因工程治療AD

NSCs具有遷移性，以NSCs為載體的基因治療可起到雙重作用：一方面NSCs可自我復制，使轉染的外源性基因不斷增加，并隨干細胞的遷移廣泛表達；另一方面，表達的外源性基因還可誘導自身干細胞定向分化，替代損傷的神經細胞。外源性基因(如NT，代謝酶等基因)經分子生物學技術轉染NSCs，使NSCs表達各種營養因子或酶，阻止神經元變性死亡，或釋放所缺失的神經遞質，部分修復神經環路。轉染hNGF的hNSC可以穩定表達hNGF，并且表達量比對照組多近10倍，能夠抵抗過氧化氫(H2O2)、Aβ、鵝膏蕈氨酸的毒性反應，保護NSC活性。將其移植治療鵝膏蕈氨酸誘導的認知缺陷小鼠，可明顯提高學習記憶能力〔43〕。另有研究者利用轉染技術將腦啡肽酶(一種Aβ降解酶)轉染至NSCs，使其表達并分泌腦啡肽酶，將這種干細胞移植到AD模型鼠腦內，發現Aβ斑塊顯著減少并且突觸密度增加〔23〕。

此外，體外狀態下很難長時間維持原代NSCs存活，為了更好的研究NSCs的特性，人們通過基因轉移技術得到永生化NSCs系，為體外研究提供了更好的來源。Liu等〔44〕將表達NT的永生化C17-2 NSCs移植到PD大鼠模型紋狀體中，移植后C17-2 NSCs分化為神經元和膠質細胞，并表達NT，發揮多巴胺能神經保護作用。但是，國內研究者王彬等〔45〕將逆轉錄病毒介導v-myc基因轉染人NSCs并進行皮下移植，發現腫瘤形成。一些研究者認為細胞轉染v-myc基因存在風險，這些細胞在發生永生化的同時也會促進腫瘤的形成〔46〕。所以，針對逆轉錄病毒將編碼癌基因蛋白的基因(如v-myc)轉染得到永生化的NSCs是否存在致瘤性的問題，仍需要大量研究。

5 問題與展望

近十幾年來，NSC移植治療AD取得了令人歡欣鼓舞的成績，但只停留在動物實驗階段，NSC移植治療AD患者鮮有報道。要想進一步推進臨床治療，還有大量工作亟待解決：① NSC移植方式、時間、移植細胞數目目前尚無統一標準，且僅有動物研究的數據。② 移植的NSCs雖然有遷移至Aβ區域的傾向，但仍無法抵達所有的損傷部位，如何誘導NSC靶向遷移？③ 靶區微環境可以影響NSC分化，分化過程的不同階段所需的分化因子不同，同一分化因子不同階段所需的濃度不同，如何定向誘導NSC分化為功能性神經元？④ AD腦內的病理變化如Aβ沉積、炎癥反應均不利于外源性NSC存活，如何最大程度避免其損害？⑤ AD是一種多病因的神經退行性疾病，在疾病某一階段聯合治療是否能取得更好的療效？⑥ NSC移植的長期療效及移植所帶來的副作用如何評價？這些問題需要進一步解決。