乙酰肝素酶靶向治療心肌梗死的前景

曹洪帥 馬俊彪 韓軒茂

(內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙 包頭 014040)

乙酰肝素酶(HPSE)是一種內切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳動物細胞中唯一可以切割細胞表面的硫酸乙酰肝素側鏈的酶，參加細胞外重塑。HPSE涉及多種生理過程如胚胎植入，組織修復和炎癥過程；病理致病過程主要包括腫瘤的進展和腎臟疾病。HPSE在多種惡性腫瘤病理發展過程中呈現高表達、高活性狀態，有可能成為一個抗腫瘤治療的新靶點〔1〕。本文探討HPSE在心肌缺血再灌注(I/R)損傷發病中的作用，及可能的分子機制，為今后心肌梗死的監測、治療及預后評估開辟新方向，具有重要的基礎及臨床意義。

1 HPSE的認識

硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖(HSPGs)在血管生物學中的廣泛發生，1999年Vlodavsky等〔2〕通過提純HPSE分離得到HPSE基因，該基因通過肝素結合型堿性成纖維細胞生長因子的活化，誘導血管生成。HSPGs通過聯合結構、生化及其調控等不同機制發揮多重功能作用，通過與其他大分子如層黏蛋白、纖維蛋白和膠原Ⅰ、Ⅳ相互作用，有助于細胞外基質和基底膜的結構完整性、自我排列及不可溶性，可密切調控細胞-細胞外基質間的相互作用，參加細胞外重塑。HPSE mRNA編碼65 kD前體酶，經翻譯后切割成非共價締合以形成活性HPSE的8 kD和50 kD亞基。HPSE結構中含有酶的活性位點和底物結合結構域，及HPSE分泌和信號傳導功能至關重要的C-末端結構域。HS的生物合成在高爾基體系中進行，HS鏈的合成和修飾需要一系列酶的活性，但哺乳動物HS的降解主要由一種酶——HPSE進行，其將HS側鏈切割成10～20糖單位的片段。隨后的研究表明，HPSE參與各種病癥如癌癥，慢性炎癥，動脈粥樣硬化和腎功能障礙等的發病與進展〔3〕。這些研究最有價值的成果就是，HPSE從一種不太了解功能的模糊酶發展成為一些腫瘤疾病的藥物靶點，為腫瘤疾病的治療及預后評估開辟新方向，拓寬了HPSE抑制劑在其他領域的臨床應用范圍，具有重要的基礎及臨床意義。

2 HPSE對疾病的影響

鑒于HS的功能多樣性，HPSE的降解深刻影響著重要的病理生理過程，包括腫瘤發展，新生血管形成和炎癥，糖尿病及腎臟疾病的進展。肝素酶介導的降解和隨后的腎小球細胞中HS的重塑是腎小球疾病發展的關鍵機制。血管是一種高度活躍的結構，其形態可以在系統和局部變化下做出快速調節適應并維持血管功能。在一些病灶中如再狹窄、血栓形成、動脈粥樣硬化，這種正常有益的適應可能對整體功能有害。HPSE依賴對動脈結構力學和修復的酶學的獨立作用密切調節血管內支架術后的動脈順應性和新生內膜增生。此外，HPSE促進血管損傷后的血栓形成，并有助于人類頸動脈粥樣硬化中的促凝血狀態。重要的是，HPSE與動脈粥樣硬化斑塊的發展和進展密切相關，包括對不穩定斑塊轉變穩定。因此，急性心肌梗死患者血漿中HPSE水平明顯升高，有可能作為急性心臟病診斷標記和潛在的藥物治療靶點〔4〕。HPSE誘導細胞因子產生機制尚未完全明了，但包括toll樣受體(TLRs)，TLRs是I型轉膜蛋白的一個家族，結合一系列細菌產物，通過核因子(NF)-κB激活促炎性介質〔5〕。HPSE誘導細胞因子似乎涉及TLR-2、TLR-4、和NF-κB。HPSE經TLR激活巨噬細胞，產生炎癥因子，促進炎癥反應：許多研究顯示，炎癥在冠狀動脈疾病中起關鍵作用。活化的免疫細胞在斑塊破裂處密集存在，產生大量的炎癥分子和蛋白水解酶，促使穩定斑塊向易損、不穩定轉化〔6〕。HPSE，NF-κB和熱休克蛋白(Hsp)70基因表達參與三硝基苯磺酸(TNBS) 誘導的炎癥反應，代表腸道抗炎藥物的藥理學靶點〔7〕。

HPSE表達在正常上皮細胞中是罕見的，但通常在腫瘤中誘導，在各種類型的癌癥(包括宮頸癌)中升高，與預后不良相關。異種移植小鼠模型用于研究體內HPSE輻射調節劑的作用，輻射后的集落形成測定以比較對照HPSE敲低和HPSE過表達HeLa細胞之間的輻射響應。檢測缺氧誘導因子(HIF)1，堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)的mRNA和蛋白水平作為HIF1通路活性的指標。研究結果表明，HPSE是體內和體外輻射反應的重要調節劑〔8〕。

在糖尿病，心臟對產生能量的脂肪酸(FA)具有單一依賴性，通過分解循環甘油三酸酯的冠狀動脈脂蛋白脂肪酶(LPL)來實現。冠狀動脈LPL源于心肌細胞，并轉移到血管腔，該酶需要從肌細胞表面HSPGs中釋放出來，這是慢性高血糖后需要持續的活性。有研究表明，在肝素酶過表達(HPA-tg)的轉基因小鼠中發現HPSE可以改善葡萄糖體內平衡。除了胰島組成和結構的變化之外，HPSE過量表達與增加的葡萄糖刺激的胰島素分泌和高胰高血糖素血癥有關。引人注目的是，與野生型相比，在給予單次高劑量鏈脲佐菌素(STZ)的動物使胰島B細胞損傷，從而導致相關的高血糖嚴重和快速發展的模型中，HPA-tg小鼠顯著降低血糖，揭示使用HPSE在糖尿病管理中的可行性機會〔9〕。

3 HPSE的調控表達

3.1調控相關的信號轉導通路

3.1.1絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路 MAPK信號轉導通路可以參與調控多種細胞生物學效應，尤其是在細胞增殖、分化及凋亡過程中，是多種信號轉導途徑的共同作用部位。MAPK被激活后轉移至細胞核內，使一些轉錄因子發生磷酸化，改變細胞內基因表達的狀態。另外，它也可以使一些其他的酶發生磷酸化，活性發生改變。在哺乳動物細胞內存在的重要MAPK亞家族主要包括細胞外調節激酶(ERK)，c-Jun N-末端激酶/應激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38MAPK。

近年來有研究發現，HPSE可以通過影響MAPK信號轉導途徑，促進腫瘤細胞的惡化與侵襲過程。Nadir〔10〕發現在腫瘤細胞內存在HPSE過表達現象，由于HPSE過表達導致MAPK被激活，激活MAPK后轉移至細胞核內，使發生磷酸化，改變細胞內基因表達的狀態。另外，它也可以使一些其他的酶發生磷酸化、活性發生改變，促進腫瘤細胞的轉移和侵襲因子的增強。說明可以通過抑制HPSE的表達從而阻斷MAPK信號轉導途徑，為抑制腫瘤細胞的惡化與侵襲提供新的方向。

3.1.2磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑 PI3K不僅有抗凋亡作用而且是一種重要的信號轉導分子。HPSE過表達后，PI3K通過其p85亞單位與活化的受體結合，使其p110亞單位被受體磷酸化而活化。PI3K可催化三磷酸肌醇(PIP3)的產生。PIP3產生后，通過結合蛋白激酶(PK)B的PH結構域，將其錨定于質膜而活化。PKB是原癌基因c-Akt的產物，故又稱為Akt。PKB可磷酸化多種蛋白，最終結果就是組織細胞凋亡，引起血管生成，促進了腫瘤細胞的增殖。破壞HPSE C-末端結構域或抑制HPSE的表達均可以降低Akt的磷酸化水平，起到抑制腫瘤病情進展的作用。

3.2HPSE的調控 腫瘤缺氧時，可以激活HPSE，HPSE高表達過程或參與了對其活性的調控。HPSE的生理活性與環境pH密切相關，最佳表達活性pH為5.5～5.8，這時HPSE發揮其酶活性，結合HS。當pH>7.0時，HPSE的酶活性被其黏附活性所取代，無法發揮酶切作用。當pH下降，如炎癥時，HPSE則可發揮其酶活性，裂解它所連接的HSPG，釋放白細胞，并促發炎癥反應〔11〕。

HPSE啟動子區域富含GC結構，可以結合相關的調控因子調節HPSE的表達。另外HPSE還存在甲基化位點，啟動子的甲基化可以抑制HPSE的表達，而DNA的去甲基化可以上調HPSE的表達水平。簡言之，HPSE的表達調控在轉錄水平主要通過結合轉錄因子和甲基化來實現的。

凡可以與HPSE啟動子區所含的核心基序GGGCGG結合的轉錄因子，都可以調控HPSE的表達，其中早期生長反應基因(EGR1)，轉錄因子Sp1，NF-κB，E-twenty six轉錄因子(ETs)家族因子 (ETs1 和 ETs2) 等對HPSE的表達起正向調節作用，此外還包括由雌二醇和葡萄糖通路所誘導的部分轉錄因子；而抑癌基因 p53 和 DNA 甲基化可抑制HPSE的轉錄，是HPSE表達的負向調控因子。

近年來在Hao等〔12〕研究中，首次報道肝細胞生長因子(HGF)調節HPSE表達以促進胃癌轉移。研究發現HGF和HPSE在58例胃癌患者中顯著表達。 而且HGF和HPSE的高表達與TNM期，侵襲深度和預后差呈正相關。在MKN74細胞中，外源性HGF在mRNA和蛋白質水平上顯著增加HPSE表達。

MicroRNAs(miRNAs) 是一類保守的非編碼單鏈 RNA，約8～25 個核苷酸，通過與靶基因 mRNA 互補位點的結合在轉錄后水平調控靶基因的表達。miRNA-558在HPSE啟動子中識別出其互補位點，以降低SMAD家族成員SMAD 4在Argonaute 1-依賴性方式的結合。有實驗表明〔13〕，miR-558通過減弱SMAD4介導的HPSE表達抑制來促進胃癌細胞系的體外和體內腫瘤發生和侵襲性。在臨床胃癌標本中，miR-558的上調和SMAD4的下調與HPSE表達呈正相關。

4 HPSE在I/R模型中的影響

盡管HPSE聚糖在血管生物學中的廣泛發生和影響，但HPSE在血管壁疾病中的意義被低估。有研究顯示，血液和動脈組織HPSE過度表達，在急性冠脈綜合征(ACS)發病中起雙重作用，協同促進動脈粥樣硬化和血管內血栓形成〔3〕。幾項研究表明，HPSE的過度表達及其對HSPGs的破壞可能是許多與糖尿病相關并發癥的原因，特別是導致慢性腎臟疾病，動脈粥樣硬化和ACS〔14〕。

心肌I/R損傷是指缺血心肌在恢復灌注以后，病情反而加重，引起的心肌超微結構的不可逆性改變，造成心肌功能、代謝及電生理方面的進一步損傷。心肌I/R損傷常見的機制有Ca2+超載、氧化應激、凋亡與自噬等，一些微小RNA及TLRs等也參與其中，這些機制相互聯系，相互作用。心肌纖維化，又稱為心肌鈣化，是由中、重度的冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續性和(或)反復加重的心肌缺血缺氧所產生的結果，導致逐漸發展為心力衰竭。

有資料顯示〔15〕，I/R是急性腎衰竭和延遲移植功能的重要原因，可通過激活腎小管細胞的上皮至間質轉化(EMT)而誘導慢性腎損傷，HPSE在其中可能具有重要的作用。在WT和HPA-tg小鼠中誘導急性缺血。將WT和HPA-tg小鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，皮下注射)麻醉，并置于受控加熱(溫度調節)臺上，保持體溫在37℃。暴露右側和左側腎動脈并夾持30 min，在此期間腎臟保持溫暖和潮濕。然后取出夾子，觀察腎臟血流返回，并縫合腹壁切口。使小鼠在溫暖的籠中恢復48和72 h，并在每個時間點獲得血液樣品以測量肌酸酐。所有小鼠通過吸入CO2然后頸脫位處死。收獲腎并稱重。除了腎動脈夾緊之外，進行相同操作的假手術小鼠作為對照。結果發現I/R在動物模型中引起HPSE上調，過表達HPSE的小鼠活化EMT，與野生型相比，HPA-tg動物對腎功能損傷更敏感。總的來說，研究結果表明HPSE是I/R誘導EMT的發展的關鍵因素，其抑制可能代表一種新的有價值的治療方法，以最小化預防纖維化。

5 HPSE的靶向治療進展

綜上，HPSE的表達與腫瘤的惡化和轉移有著密不可分的聯系，理論上通過抑制HPSE的活性可以降低腫瘤細胞的轉移性和侵襲力，為臨床上，控制腫瘤的轉移開辟新的途徑。基于序列分析，二級結構預測和誘變分析，通過研究HPSE水解五糖底物磺達肝素的光譜，表明HPSE以保留配體的形式水解其底物，因此HPSE被確定為保留糖苷酶〔16〕。目前，HPSE抑制劑的研究取得了突破性進展〔17〕，主要來源于多糖化學修飾、高通量的天然產物，一方面可以降解HPSE，另一方面可以抑制HPSE的表達，尤其是HS類似物-PI88已經進入臨床研究階段，且在研究階段志愿者身上呈現出較好的耐受性和療效。PI88不僅是HPSE的抑制劑，也是血管生成因子VEGF的阻抗因子，達到抗血管生成的目的，最終阻滯腫瘤的發展。

Singh等〔18〕使用APC Min+/-小鼠模型提供證據表明，HPSE下調了p21 WAF1/CIP1的表達，p21表達的下調增加了HPSE新出現的促致癌性質的新特征。值得注意的是PG545是有效的HPSE抑制劑，該化合物有效降低細胞增殖，集落形成和腫瘤異種移植物生長，與p21表達明顯增加相關。PG545有效誘導p21使其抗腫瘤作用表現樂觀。

隨著免疫學與分子生物學的快速發展，針對HPSE的免疫治療和基因治療研究也取得了顯著成果。HPSE 僅在腫瘤組織、淋巴組織中存在表達，提示我們可以研究一種廣譜的腫瘤轉移相關抗體拮抗HPSE達到抑制腫瘤轉移的目的。有研究表明，誘導多肽抗體生成可以有效地降低肝癌細胞的 HPSE 活性，從而降低了肝癌細胞的侵襲能力，為研究抗 HPSE 抗體和臨床使用的疫苗提供了新的理論依據。在基因治療水平方面，Parish等〔19〕發現乙酰肝素酶與活化的Jurkat T細胞中數百種基因和微RNA的啟動子和轉錄區域相互作用，并且上調許多靶基因/微RNA。在分子水平上，通過影響去甲基化酶對轉錄活性基因的募集，核肝素酶似乎調節組蛋白3賴氨酸(H3K)4甲基化。總體上通過miRNA與HPSE啟動因子的mRNA結合位點結合，調節信號通路，下調生長因子的表達，阻止腫瘤轉移。

6 展 望

目前，多數研究集中于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病人HPSE在動脈粥樣硬化斑塊形成與發展中的作用以及體內HPSE表達水平對惡性腫瘤嚴重程度的影響。而心肌細胞凋亡和纖維化、心肌細胞肥大等心肌組織重構方面的研究比較少，尤其是對于嚴重影響人類健康、具有較高的再住院率和致死率的心力衰竭在發生發展過程中心肌細胞負性重構的研究少有報道。我們借助乙酰肝素酶及其相關因子在白血病中表達水平的研究經驗〔20〕，采用多種研究方法，研究患者全身及血小板HPSE與心肌I/R的相關性；重點研究HPSE對心肌細胞的纖維化和凋亡的影響，探討HPSE在心肌I/R損傷發病中的作用，及可能的分子機制，為今后心力衰竭的監測、治療及預后評估開辟新方向，拓寬在其他領域中，HPSE阻滯劑臨床應用范圍，具有重要的基礎及臨床意義。