腺病毒載體用于動脈粥樣硬化基因治療的研究進展

王琳 張珂欣 劉艷穩 冷吉燕 秦俊杰

(吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

除了大約20年前進行的一項關于低密度脂蛋白受體基因預防家族性高膽固醇血癥患者早期動脈粥樣硬化的預實驗〔1〕，目前對動脈粥樣硬化的基因治療仍然停留在臨床前階段。潛在的動脈粥樣硬化基因治療包括操縱血漿脂蛋白通過基因轉移到肝臟和直接基因轉移到血管壁防止或逆轉動脈粥樣硬化病變生長。本文將探討腺病毒載體用于動脈粥樣硬化基因治療的研究進展。

1 腺病毒介導的靜脈移植治療動脈粥樣硬化

多年以來，心血管疾病一直是導致死亡、殘疾的最主要原因，尤其是動脈粥樣硬化導致的心臟病〔2,3〕。動脈粥樣硬化的發病率和死亡率最主要原因是累及冠狀動脈，其中內膜脂質和炎性細胞的積累導致管腔狹窄、血流減少、血栓性閉塞，并伴有胸痛、心肌梗死、心力衰竭和猝死等相關癥狀〔4〕。盡管經皮冠狀動脈介入治療(如血管成形術和支架植入)取得了進展，但冠狀動脈旁路移植術(CABG)仍然是治療嚴重冠狀動脈疾病的主要方法〔5～7〕。因此，各個國家每年均仍有數以萬計的CABG手術〔8〕。然而，構建CABG的大隱靜脈段的高閉塞率卻限制了CABG的長期益處。CABG靜脈移植通暢率1年估計為80%，10年估計為50%〔9，10〕。

目前用于預防移植靜脈粥樣硬化的藥物主要為降脂藥物，以他汀類藥物為代表〔11〕。他汀類藥物在絕大多數CABG受者中都有應用，然而，沒有證據表明廣泛使用他汀類藥物會增加靜脈移植的通暢率，也有證據表明通暢率正在下降〔12〕。此外，他汀類藥物治療僅在一定程度上是有效的：他汀類藥物誘導低密度脂蛋白膽固醇降低到<100 mg/dl，可增加移植血管通暢；然而，進一步降低到<70 mg/dl，則沒有額外的好處〔13〕。移植靜脈粥樣硬化可通過動脈旁路移植而避免，如左胸內動脈10年通暢率>95%。然而，任何一個CABG患者只有一個左側胸內動脈，但幾乎所有的CABG患者都需要超過1個旁路血管。與僅使用左胸內動脈和靜脈移植相比，使用左胸內動脈和右胸內動脈進行旁路移植術并不能改善心血管結果，而且與胸骨傷口感染顯著增加有關〔14〕。橈動脈偶爾也被用作CABG導管；然而，他們的長期通暢率和相關的臨床結果并不優于靜脈移植〔15〕。

如今，很多專家提出了基因療法，作為一種很有前途的方法預防靜脈移植物粥樣硬化〔16，17〕。基因治療靜脈移植物粥樣硬化將包括在移植物本身中表達一種治療性基因，該基因被選擇用于防止脂質積聚、炎癥或血管重構，這些因素被證實是導致動脈粥樣硬化快速發展的原因〔18〕。然而，動脈粥樣硬化的基因治療進展長期受到轉基因持久表達需要的限制，而這一點可能是預防疾病進展發展的必要條件。最近有報道表明，用輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd)轉導的兔靜脈移植至少在24 w內產生轉基因表達，4 w后穩定表達〔19〕。用同樣HDAd轉導的家兔動脈達到轉基因表達至少需要48 w，穩定表達仍需4 w〔20〕。因為HDAd似乎能夠介導血管中轉基因的持久表達，所以HDAd是一種很有前途的載體，可以進一步開發用于血管移植物粥樣硬化的基因治療。

2 腺病毒載體介導的前胸腺素-α基因轉染抑制動脈粥樣硬化

氧化應激是由于抗氧化劑減少或活性氧(ROS)過量生成造成的，被認為是內皮功能障礙的發病機制和動脈粥樣硬化起始與進展的主要機制。清除血管內ROS并抑制一氧化氮(NO)降解的防御機制包括酶促過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶以及非酶促低分子團。NO是主要的血管擴張劑，是通過內皮NO合成酶(eNOS)合成的。超氧化物通過與血管NO反應或減少血管NO生物利用度來促進細胞損傷。由于超氧化物的血管水平受SOD調控，因此，SOD基因在心血管疾病中的作用具有重要意義。

Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1和核因子E2相關因子(Nrf)2是氧化應激的重要細胞傳感器。在無應激細胞中，Nrf2通過與抑制蛋白Keap1結合被隔離在細胞質中，然后通過蛋白酶體系統被降解。在暴露于親電性與氧化應激下，Nrf2從Keap1中釋放，然后轉移到細胞核中，與Maf形成雜二聚體，并與抗氧化反應元件(AREs)結合，調控ARE介導的基因表達。之前有研究表明，前胸腺素α(ProT)能夠將Nrf2從Nrf2-Keap1抑制復合物中釋放出來，調節氧化應激保護基因的表達。ProT是一種高酸性的小蛋白質，分布在多種組織的細胞核中，在哺乳動物中高度保存。許多研究〔21，22〕都顯示了ProT的免疫調節功能，包括增強人類主要組織相容性抗原(MHC)Ⅱ類表面抗原在抗原遞呈細胞上的表達及人類自然殺傷細胞的細胞毒性。此外，ProT可能對轉錄有更廣泛的影響，它影響特定轉錄因子的活性，包括雌激素受體和信號轉導與轉錄激活因子(Stat)3。

在一些研究〔23〕中，人們使用表達ProT(指定AdProT)的腺病毒檢測ProT基因轉染對抗氧化基因表達的影響，從而研究ProT介導的內皮細胞在體外和體內氧化損傷的保護作用。

3 腺病毒載體介導的鞘磷脂合成酶2增加動脈粥樣硬化損傷

鞘磷脂(SM)參與了許多重要的生物學功能，包括細胞膜的形成、信號轉導和脂質代謝，這些都與動脈粥樣硬化的發展有關。SM是主要的磷脂之一。血漿膜SM和SM/(PC)比值是冠心病的獨立危險因素；此外，這些脂質在人類和動物模型的動脈粥樣瘤中積累。先前的研究〔24〕表明，從人類動脈粥樣硬化病灶中提取的低密度脂蛋白(LDL)富含SM，載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的血漿SM水平比野生型小鼠高4倍，這可能在一定程度上解釋了這些小鼠動脈粥樣硬化的增加。血膽固醇高的家兔的極低密度脂蛋白(VLDL)中SM水平增加了5倍。作為SPT的抑制劑(SM生物合成途徑的第一關鍵酶)，肉豆蔻素的使用顯著降低了ApoE 敲除小鼠的血漿SM水平和動脈粥樣硬化病變。這些數據表明，升高的血漿SM水平可以促進動脈粥樣硬化的發生。鞘磷酸酶(SMS)是SM生物合成的最后一種酶，具有SMS1和SMS2兩種亞型。有實驗表明，SMS1和SMS2的過表達增加了小鼠的脂蛋白動脈粥樣硬化潛能，促進了細胞凋亡。動脈粥樣硬化是由動脈粥樣硬化性脂蛋白與動脈壁相互作用引起的，許多過程都與早期的動脈粥樣硬化有關。其中，脂蛋白的保留和聚集是關鍵步驟。近年來有研究〔25〕生成含有人類SMS2 cDNA和綠色熒光蛋白(GFP)cDNA的重組腺病毒載體，并將重組腺病毒載體靜脈輸注給ApoE基因敲除小鼠，結果表明，SMS2過表達在動脈粥樣硬化形成中發揮一定的作用，并且提供了直接的形態學證據，表明SMS活性升高可以促進小鼠動脈粥樣硬化。

4 前蛋白轉化酶/枯草桿菌蛋白酶9型編碼重組腺相關病毒載體誘導動脈粥樣硬化形成

動脈粥樣硬化可通過生殖系基因工程在動物體內實現，導致高膽固醇血癥，但這類模型局限于少數物種和菌株，很難與涉及基因操縱或變異的其他強大技術相結合。為了建立無種系遺傳工程的動脈粥樣硬化的誘導方法，近年來有研究將設計重組腺相關的病毒載體用于編碼功能獲得性前蛋白轉化酶/枯草桿菌蛋白酶9型突變體，并給予小鼠靜脈注射載體，然后進行高脂飲食喂養。結果表明：單一注射前蛋白轉化酶/枯草桿菌蛋白酶9型編碼重組腺相關病毒載體是一種快速、通用的動物動脈粥樣硬化誘導方法〔26〕。這種方法對于高通量或涉及遺傳技術、毒株或與現有的基因工程模型不能很好結合的物種的實驗能夠起到重要作用。

近些年來，腺病毒載體在動脈粥樣硬化基因治療的應用上確實取得了顯著的進展。隨著對腺病毒分子生物學研究的進一步深入及人們對動脈粥樣硬化發病機制的全面了解，在未來必將有滿足需要的腺病毒載體引入臨床，為心血管系統疾病的治療提供新思路。