不同方法誘導的γδT細胞體外抗肺癌作用比較

趙鑫 常穎 劉玉俠 王寶 盧衛平 王啟文

(1吉林省腫瘤醫院 ，吉林 長春 130012；2吉林省腫瘤防治研究所)

肺癌在我國已經成為常見的惡性腫瘤，近年來發病率居高不下，其常規治療方法有手術、化療、放療等，但治療后有許多病人會出現轉移和復發，其原因與化療、放療后機體的免疫功能下降有關。針對這一現狀，對放化療后患者提高免疫力進行預防腫瘤轉移和復發就顯得尤為重要。如何提高免疫力，預防腫瘤轉移和復發，目前的研究已經證明樹突細胞(DCs)、細胞因子活化的殺傷細胞(CIK)、自然殺傷細胞(NKs)、γδT細胞等免疫細胞對提高機體的免疫功能發揮著重要作用。而近年來的研究證實，γδT細胞在抗腫瘤免疫反應中發揮著獨特的作用。眾所周知，體內起主要作用的抗腫瘤細胞是T淋巴細胞。T細胞根據表面抗原受體(TCR)的不同分為αβT細胞及γδT細胞。在機體內，αβT細胞主要通過主要組織相溶性抗原(MHC)限制性識別腫瘤細胞，參與獲得性免疫，使其應用受限。而γδT細胞是一種介于獲得性免疫與天然免疫之間的細胞，其功能不受MHC限制，不依賴于抗原的處理和遞呈過程，所以近年來對其研究較多。本實驗通過用抗人TCR γ/δ聯合白細胞介素(IL)-2及唑來膦酸聯合IL-2兩種方法進行γδT的體外誘導擴增，并對肺癌細胞A549進行體外殺傷實驗，為γδT細胞的研究和用于肺癌的治療提供實驗數據。

1 材料和方法

1.1材料 IMDM細胞培養基：美國Gibco公司， 噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司，胎牛血清：Hyclone公司；IL-2：北京遠策藥業有限責任公司；淋巴細胞分離液：中國醫學科學院生物工程醫學研究所；唑來膦酸：深圳海王藥業有限公司；抗人TCRγ/δ，PE標記的抗人TCRγ/δ克隆B1:Biolegend公司。 生物倒置顯微鏡(Olympus)：日本；低溫低速離心機(SORVALL RTT)：美國；全自動酶標儀：Labsystems Dragon；超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；HERA CEEL 240iCO2培養箱，Thermo Scientific公司；流式細胞儀，BD公司。肺癌細胞A549：購于上海生物細胞研究所。

1.2方法

1.2.1人外周血γδT細胞的體外誘導、培養、鑒定 抽取健康志愿者外周血，用淋巴細胞分離液分離人外周血淋巴細胞，計細胞數為1×106/ml,加至100 ml細胞培養瓶，放入37℃，5%CO2培養箱中飽和濕度下培養。誘導方法1：取1瓶以上分離的細胞，加入抗人TCRγ/δ 0.4 μg/ml,IL-2 300 IU/ml,放入37℃，5%CO2培養箱中，每3天半量補加抗人TCRγ/δ、IL-2等細胞因子并換液，培養至第6天時，用流式細胞儀對培養的細胞進行γ/δT細胞表型鑒定及殺傷活性實驗。誘導方法2：另取1瓶分離的細胞，加入唑來膦酸10 μmol/L,IL-2 500 IU/ml,培養方法同1。取以上抗人TCRγ/δ加IL-2及唑來膦酸加IL-2的細胞進行γ/δT細胞表型鑒定。方法：分別取以上培養的細胞，調細胞數為(5～10)×105/100 μl ，加PE抗人TCRγ/δ 20 μl，冰上孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，最后加PBS 500 μl，混勻，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.2γδT殺傷實驗(MTT法) 接種腫瘤細胞。將培養至對數生長期的A549細胞接種到96孔細胞培養板，100 μl/孔。將經過兩種方法培養鑒定的γδT細胞調細胞數為2.5×106/ml,按以下設計加入到已經接種了A549的96孔細胞培養板中，100 μl/孔，每個樣品設6復孔。第1組：抗人TCRγ/δ +IL-2，第2組：抗人TCRγ/δ +IL-2+A 549，第3組：唑來膦酸+IL-2，第4組：唑來膦酸+IL-2+A549，第5組：A549。以上細胞培養48 h，培養結束前4 h加MTT(5 mg/ml) 20 μl/孔，培養結束后，小心吸去上清，每孔加150 μl DMSO，震蕩混勻，在酶標儀492 nm波長處測OD值。殺傷活性計算方法：殺傷活性=(1-實驗組OD值-效應細胞OD值)×100%/靶細胞OD值×100%。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

抗人TCRγ/δ聯合IL-2誘導的γδT細胞表達率為62.10%，對A549的殺傷活性為82.47%；唑來膦酸聯合IL-2誘導的γδT細胞表達率達61.50%，對A549的殺傷活性為81.09%，兩組細胞表達率及對A549的殺傷活性差異均無統計學意義(均P>0.05)。

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率位均居惡性腫瘤之首。雖然肺癌早期通過手術治療可以取得較好的治療效果，甚至部分患者通過手術切除后可以達到治愈。但是因為肺癌初期無明顯癥狀，發現時大多已處于晚期，使其治療效果和預后較差。在肺癌患者中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數的80%〔1〕，NSCLC根據病理類型可分為肺鱗癌、肺腺癌和大細胞肺癌等，其中肺腺癌占NSCLC的大多數。對于晚期患者，多數已不適合手術，只能采取化療、放療等方法治療，或者是手術后需要進行化療、放療等后續治療，但是這些治療會使患者的免疫功能遭受打擊，使免疫功能明顯下降，導致治療不能順利進行，影響效果。

免疫治療作為腫瘤治療的方法之一，目前在腫瘤的治療中發揮著一定作用。在免疫治療過程中，免疫細胞可以直接參與殺傷腫瘤細胞及通過分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α等具有殺傷活性的細胞因子進行抗腫瘤反應，還可以通過激活機體免疫系統提高機體免疫力達到主動抗腫瘤的效果，因此在腫瘤的綜合治療中發揮著重要作用〔2〕。目前已有多種免疫細胞用于惡性腫瘤的治療，在惡性腫瘤的治療中發揮著重要作用。

眾所周知，T淋巴細胞是主要的抗腫瘤細胞。γδT細胞是近年來發現的一種功能強大的T淋巴細胞，在機體內具有殺傷和調節雙重作用〔3〕，同時維護機體的免疫平衡，所以在腫瘤的綜合治療中發揮著非常重要作用，在抗感染等方面也發揮著重要作用〔4，5〕。在抗腫瘤過程中，γδT細胞能夠以MHC非限制性地方形式特異性識別腫瘤抗原，作為抗原提呈細胞(APC)起到抗原遞呈作用，特異性殺傷腫瘤細胞，并通過分泌IL-2、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子促進其他免疫細胞的活化〔6〕，對腫瘤細胞直接殺傷。另外，γδT細胞還能與其他多種免疫細胞相互作用，激發這些細胞發揮抗腫瘤作用。體外實驗證實，γδT細胞能殺傷多種自體腫瘤細胞或異基因來源的腫瘤細胞系，而不會影響正常細胞的功能〔7～9〕。但是由于γδT細胞在外周血中所占比例較少，只有1%～10%〔10〕，使其研究和應用得到限制。如何獲得較多數量的γδT細胞，對其功能進行深入研究成為首要解決的問題〔11〕。

唑來膦酸是雙磷酸鹽類藥物，臨床上主要用于腫瘤患者如乳腺癌、多發性骨髓瘤、肺癌、胃癌等多種實體瘤化療后引起的骨轉移和高鈣血癥的治療〔12〕。研究發現唑來膦酸還能活化人外周血γδT細胞〔13〕，它既能促進γδT細胞的生長，也能抑制腫瘤細胞生長〔14,15〕,而且與其他誘導γδT細胞的化學試劑相比，其價格要低很多。本實驗根據其特性，用其聯合IL-2培養誘導的γδT細胞與用γδT CR聯合IL-2誘導的γδT細胞進行比較，兩種誘導方法無論是在表達率還是殺傷活性方面沒有明顯差異，為γδT細胞的擴增及應用提供了經濟實用的方法。