異丙腎上腺素對心肌缺血大鼠氧化應激反應及caspase-9的影響

韓芬 楊曉

(1鄭州鐵路職業技術學院藥學院(基礎醫學部)，河南 鄭州 451460；2河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科)

目前，急性冠脈綜合征患病率大大增加，已被看作是冠心病主要的致死原因之一〔1〕。冠狀動脈血管旁路移植術、冠狀動脈介入治療、溶解血栓等均是挽救缺血心肌的主要再灌注方式〔2〕。然而盡管上述方法治療效果尚佳，但心肌再灌注損傷仍是限制各治療方法深入推行的阻礙，可見如何避免或減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷對改善患者預后尤為關鍵〔3〕。既往研究證實，β腎上腺素能受體(β-AR)參與了心電生理、心臟血液供應等生命活動，并在這些進程中發揮著至關重要的作用〔4，5〕。β1-腎上腺素受體(AR)、β2-AR均參與了心臟功能活動，在正常的生理情況下，β1-AR主要介導交感神經激動，而β2-AR則參與了心力衰竭等病理條件下的心功能調節〔6〕。本研究旨在觀察異丙腎上腺素(ISO)對心肌缺血大鼠氧化應激反應與心肌凋亡的影響，以期為急性冠脈綜合征再灌注預處理提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠40只，平均體重(227.47±19.25)g，均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2實驗儀器 DH-140動物呼吸機：泰盟科技有限公司；RM-6280型多導生理記錄分析系統：成都市儀器公司；光學顯微鏡：日本奧林普斯公司；電熱恒溫培養箱：上海圣科公司；石蠟包埋機：武漢天之瑞公司；分光光度計：上海譜元公司；酶標儀：芬蘭雷勃公司；電泳儀：BIO-RAD；數字病理掃描系統：美國Aperio公司；全自動化學發光分析儀。

1.1.3實驗試劑 ISO：美國Sigma公司；ICI118551：美國Sigma公司；20%烏拉坦：武漢博士德公司；蘇木素-伊紅：碧云天研究所；β-actin抗體、磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)單克隆抗體：美國abcam公司；原位末端標記試劑：美國Roche公司；羊抗兔二抗：Bioswamp公司；caspase-9免疫組化試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：碧云天研究所；丙二醛(MDA)試劑盒：上海酶聯生物公司；磷酸緩沖液(PBS)：聯科生物公司。

1.2方法

1.2.1大鼠模型建立 將選中的40只大鼠稱重，向其腹腔內注射5 mg/kg 20%烏拉坦麻醉。麻醉后取仰臥位使用膠布將其固定于工作臺上，密切監測動物心電圖機與呼吸機是否在正常狀態下，選擇實驗需要的相關器材，開始模型建立。方法如下：使用針型電極放置于大鼠四肢皮下，密切觀察監護儀并分析其心電圖，心電圖通常選擇Ⅱ導聯。對手術視野使用碘伏棉簽消毒，頸正中切開氣管行氣管插管，與呼吸機連接，大鼠麻醉呼吸比1∶2，根據每公斤體重提供7 ml的比值設定潮氣總量，設置呼吸頻率為80次/min。沿著大鼠胸骨左緣3～4肋間依次將皮膚、皮下脂肪、肌層分離，待心臟顯露后使用棉簽將心包輕輕分離并將左心耳部分掀起，小心結扎左冠狀動脈前降支(LAD)，使用套管將血管夾閉，30 min后將套管松開完成120 min灌流，I/R模型建立成功后，結扎血管。血管成功結扎標準：LAD供血區心肌呈灰暗狀，心電圖ST-T段抬高，放松后ST-T段回落≥50%。

1.2.2實驗模型分組 根據隨機數表法分為假手術(Sham)組、I/R組、ISO組及β2-AR拮抗劑(ICI)組，每組10只。

1.2.3大鼠模型處理方法 Sham組大鼠在LAD處僅穿線但不結扎，麻醉時間為150 min；I/R組大鼠先將LAD結扎30 min，然后放松灌注缺血心肌120 min；ISO組：先使用ISO 10 mg/kg腹腔內注射，60 min后制備心肌I/R損傷模型；ICI組：使用ICI118551腹腔注射，劑量為0.5 mg/kg，注射30 min后使用ISO腹腔內注射，劑量為10 mg/kg，注射60 min后再制備大鼠I/R模型。為了便于平衡對照，需要為Sham組、I/R組SD大鼠適量生理鹽水腹腔內注射。

1.3觀察指標 (1)心肌組織病理形態：取大鼠心肌梗死部分組織，石蠟包埋切片后染色，利用光學顯微鏡400倍觀察各組大鼠心肌組織形態；(2)P-Akt蛋白表達：使用剪刀截取心肌缺血區域組織并制備心肌碎片，裂解后離心，取上清液封存待檢。經蛋白定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備、上樣、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、顯色等方法步驟，利用化學發光法檢測。(3)心肌凋亡檢測：采用TUNEL法，將缺血心肌組織置于10%甲醛中充分固定24 h，脫水石蠟包埋，經400倍光學顯微鏡觀察，若觀察到棕色細胞核則確認為凋亡細胞，若細胞核為藍色則屬于非凋亡細胞，凋亡指數=細胞凋亡數/總細胞數×100%。(4)caspase-9蛋白表達：將大鼠灌注心肌經10%甲醛浸泡固定48 h后脫水、組織包埋、切片制作，置于載玻片上待檢。于載玻片上加入單克隆抗體，過夜，沖洗2次，向內加入山羊血清稀釋，室溫下反應2 h，將多余液體甩去，PBS沖洗玻片，吸水紙將周圍殘余液體吸除，根據需要向內加入鏈霉卵白素，標記在室溫下孵化，清洗后制備二氨基聯苯胺(DAB)溶液，室溫下顯色；再次經蘇木素浸泡20 s，自來水沖洗。干燥后鏡下觀察細胞質內caspase-9凋亡細胞，經數字病理掃描系統分析灰度值，灰度值與caspase-9表達呈負相關。(5)血清氧化應激反應：再灌注120 min后經腹主動脈抽取動脈血0.5 ml，離心后取上清液，使用氧化酶法檢測SOD表達，使用巴比妥酸法檢測MDA表達。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件，計量資料用t檢驗，4組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1心肌組織病理形態 Sham組心肌纖維結構清晰、整齊排列，胞質無水腫，間質正常；I/R組心肌纖維發生變性、中斷，可見細胞間質水腫；ISO組可見心肌纖維變性、排列紊亂，但程度較I/R組相對輕微，間質情況好；ICI組心肌纖維較ISO組變性嚴重且錯亂排列，有大量核溶解與破裂，間質明顯加寬，有大量炎性細胞侵入。見圖1。

圖1 各組心肌形態學病理改變(×400)

2.2心肌組織P-Akt表達 I/R組心肌P-Akt蛋白表達(0.57±0.11)較Sham組(0.25±0.03)明顯升高，ISO組心肌P-Akt蛋白表達(1.20±0.18)較I/R組明顯升高，ICI組心肌P-Akt表達(0.36±0.09)較ISO組明顯降低(均P<0.05)。

2.3心肌細胞凋亡比較 與Sham組〔(23.01±4.25)%〕比較，I/R組心肌細胞凋亡比例〔(40.12±6.45)%〕顯著升高；與I/R組比較，ISO組凋亡比例〔(28.41±8.11)%〕明顯降低；ICI組凋亡比例〔(41.57±8.24)%〕較ISO組明顯升高；組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.4氧化應激反應指標比較 I/R組血清SOD水平較Sham組明顯降低，MDA表達較Sham組明顯升高；ISO組血清SOD表達較I/R組水平升高，MDA表達明顯降低；ICI組血清SOD表達較ISO組明顯降低，MDA表達明顯升高；組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.5caspase-9表達 與Sham組比較，I/R組心肌纖維內caspase-9呈高表達；與I/R組比較，ISO組心肌纖維內caspase-9呈低表達；與ISO組比較，ICI組心肌纖維內caspase-9呈高表達；組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 4組SOD、MDA、caspase-9表達水平比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05；與ISO組比較：3)P<0.05

3 討 論

研究發現，使用ISO 10 mg/kg經腹腔注射預處理的方式能很好地對抗大鼠心肌I/R損傷〔7〕。Tong等〔8〕在2005年的大鼠離體試驗中發現，經ISO 10 mmol/L缺血預處理后具有一定心臟保護之效，對縮小心肌梗死面積有一定價值。但Tang等〔9〕在2011年的研究中發現，將2.5 mg/kg ISO持續皮下注射7 d 后，藥物能通過上調Cx43蛋白表達、氧化應激等機制增加心肌肥厚風險，加重心肌I/R損傷程度。

本研究中ISO組大鼠心肌組織形態規整性更好，氧化應激相關指標表達更理想，且心肌細胞凋亡比例更低，提示激活β2-AR能夠幫助I/R心肌獲益。既往與心肌I/R損傷及β-AR有關的實驗研究指出，激活β-AR會損傷心肌，但也可能保護心肌〔10～12〕。β1-AR將對蛋白激酶A產生激活之效，抑制細胞色素-C氧化酶活性，加重再灌注梗死程度；而β2-AR則主要通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)途徑對抗心肌I/R損傷〔13，14〕，這些論述均與本研究結果近乎一致。

本次研究結果提示ISO可能通過激活心肌I/R損傷大鼠PI3K-Akt通路對心肌凋亡產生抑制，進而對心肌I/R損傷產生保護作用，該機制與最新研究中提出的大鼠心肌I/R經藥物預處理后起到的心肌保護作用類似〔15〕。在心肌I/R損傷挽救酶信號系統中，PI3K-Akt通路是最關鍵的信號通路之一，故調節細胞的凋亡過程是該信號通路最顯著且關鍵的作用之一〔16〕。caspase家族是PI3K-Akt信號通路下游細胞凋亡家族，被看作是凋亡信號傳導主要途徑，屬于天冬氨酸特異性水解酶，富含半胱氨酸〔17，18〕。caspase-9是該家族中主要的細胞凋亡執行因子，能夠在其他相關細胞調解下，對核內核酸酶直接激活，導致細胞蛋白質、DNA裂解，觸發甚至增加細胞凋亡〔19〕。近年來，氧化應激損傷逐漸被認為是心肌I/R損傷發生、發展的關鍵環節，SOD是抑制氧自由基損傷的重要屏障，能夠對還原氧自由基產生催化之效，合成H2O2，在受到過氧化氫酶的刺激后能夠在機體內還原為氧合水，對人體無害；MDA是膜脂質過氧化產物，其表達能夠直觀反映心肌細胞氧化應激程度。本研究結果顯示，ISO組大鼠氧化應激水平顯著降低，提示ISO能夠顯著減輕心肌缺血大鼠氧化應激反應，以對抗大鼠心肌I/R損傷。

綜上所述，ISO對心肌I/R損傷可產生保護之效，其機制可能與β2-AR興奮、PI3K-Akt途徑激活有關，能夠有效抑制心肌細胞凋亡，起到抗氧化應激之效；但因ISO在使用期間可能導致心肌損傷，誘發心律失常，故對于ISO應用的安全性機制還待深入研究，其用于心肌I/R損傷的治療仍需要在未來進行大量研究加以證實。