睪丸蛋白聚糖1對膽囊癌細胞生長凋亡的影響及機制

趙鵬偉 柳嚴 劉延 張佳偉 劉江偉 黃建釗

(貴州省人民醫院肝膽外科，貴州 貴陽 550002)

膽囊癌屬于消化系統的惡性腫瘤，其致死率高于多數消化道惡性腫瘤，近年來，膽囊癌分子發病機制越來越受到廣大學者的關注，研究基因在膽囊癌發病中的作用也是目前提高膽囊癌治療的重要途徑〔1，2〕。睪丸蛋白聚糖(SPOCK)1在腫瘤中異常表達，其編碼的蛋白屬于骨黏連蛋白家族成員，與細胞形態維持、增殖等有關〔3，4〕。近年來的研究表明，SPOCK1沉默后可以發揮抗腫瘤作用，對于食管癌、膠質瘤、膽囊癌等細胞的生長、轉移具有抑制作用，并且沉默SPOCK1還可以誘導膠質瘤細胞的凋亡〔5～7〕。本研究旨在探討SPOCK1沉默后膽囊癌細胞的生長、凋亡情況，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 膽囊癌細胞GBC-SD購自美國ATCC；信號轉導與轉錄因子(STAT)3抗體購自美國Abcam；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-抗體購自美國BOSTER；膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡測定試劑盒購自碧云天研究所；Real time PCR試劑盒購自大連TAKARA；磷酸化的STAT3(p-STAT3)抗體、SPOCK1抗體購自美國CST；Lipofectamine 2000購自美國invitrogen；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自北京TIANGEN；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京索萊寶；SPOCK1 siRNA和siRNA control購自美國biorbyt。

1.2細胞分組轉染 膽囊癌細胞密度為80%時，進行細胞轉染，在轉染前用不含血清的培養液饑餓培養細胞1 d。轉染操作步驟參照脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000。膽囊癌細胞中轉染SPOCK1 siRNA和siRNA control后記為干擾組和陰性組，并以不做轉染的膽囊癌細胞記為對照組。膽囊癌細胞培養于37℃，5% CO2和95%空氣的培養箱內，細胞用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，用10%胎牛血清的RPMI1640培養。

1.3Real Time PCR法測定膽囊癌細胞中SPOCK1的轉錄水平 對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞在分別培養2 d以后，用Trizol試劑提取各組膽囊癌細胞內的總RNA，RNA保存于-80℃。取RNA，進行cDNA反轉錄后，用Real Time PCR測定SPOCK1水平。2-△△Ct法計算，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。引物序列：SPOCK1正義鏈5′-CATGGGTTGGACCTTCGA-3′，反義鏈5′-CTTTGGTGGCTCAGGCTCT-3′。GAPDH正義鏈5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義鏈5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4Western印跡測定膽囊癌細胞中SPOCK1蛋白表達水平 對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞分別培養2 d以后，收集各組膽囊癌細胞，加入蛋白裂解液，放置在冰上裂解約30 min以后，在低溫離心機10 000 r/min離心15 min。用移液槍吸取上清，按照BCA法對蛋白進行定量檢測。以每孔上樣孔添加40 μg蛋白進行電泳，在電泳前，蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液在100℃煮沸，以90 V電壓電泳，待染料進入到凝膠的底部時，終止電泳。將凝膠上的蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，轉膜條件為：90 V，4℃。把膜放在5%牛血清白蛋白中室溫孵育1 h，然后把膜放在1∶600稀釋的一抗中孵育過夜以后，再將膜放在1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育2 h。DAB顯色以后，用Gel Doc2000對各目的條帶進行定量，以GAPDH為內參。

1.5噻唑藍(MTT)法檢測膽囊癌細胞增殖 MTT是一種黃色的染料，其可以被活細胞產生的乳酸脫氫酶還原，形成難溶解的藍紫色結晶，而這種結晶物的產生量同活細胞的數目呈正相關，檢測其在490 nm的A值可以反映出活細胞的數量。對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞種植到96孔板，接種密度約為每孔添加3 000個細胞，在2 d后添加MTT，每孔20 μl，置于37℃孵育3 h。把上清吸盡以后，按照每孔添加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)把結晶溶解以后，測定490 nm的A值。

1.6細胞克隆實驗檢測膽囊癌細胞克隆形成能力 細胞克隆實驗用于檢測單個細胞的增殖能力，單個細胞在經過約6代的增殖以后，可以形成一個細胞群體，成為克隆，當一個克隆內的細胞數目大于50時，可用肉眼直接觀察到克隆。對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞種植到24孔板內(用不含血清的培養液懸浮)，每個孔中添加約200個細胞，約14 d以后，用PBS清洗各孔，用多聚甲醛固定以后，吉姆薩染色。計數大于50個細胞的克隆數目。用克隆形成數目占接種細胞數目的百分比表示克隆形成率。

1.7流式細胞術檢測膽囊癌細胞凋亡情況 對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞在分別培養2 d以后，收集各組細胞，在細胞內加入結合緩沖液500 μl，再依次添加5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混合以后，把細胞放在避光條件下，孵育結合15 min。用流式細胞術測定各組膽囊癌細胞凋亡情況。在結果中右上象限和右下象限表示凋亡的細胞，左上象限表示壞死的細胞，左下象限表示正常的細胞。

1.8Western印跡法檢測膽囊癌細胞中STAT3、Cleaved Caspase-3、p-STAT3蛋白水平 對照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細胞在分別培養2 d以后，按照Western印跡法測定各組膽囊癌細胞中STAT3、Cleaved Caspase-3、p-STAT3蛋白水平，一抗稀釋：STAT3以1∶800稀釋、Cleaved Caspase-3以1∶600稀釋、p-STAT3以1∶600稀釋。

1.9統計分析 采用SPSS21.0軟件行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1轉染后的膽囊癌細胞中的SPOCK1 mRNA和蛋白水平 膽囊癌細胞中轉染SPOCK1 siRNA后，細胞中SPOCK1 mRNA和蛋白水平均明顯降低，而膽囊癌細胞中轉染siRNA control對細胞中SPOCK1 mRNA和蛋白水平沒有影響。SPOCK1 siRNA可以明顯下調膽囊癌細胞中SPOCK1轉錄和表達。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測膽囊癌細胞中SPOCK1蛋白表達

組別SPOCK1 mRNASPOCK1蛋白對照組1.00±0.000.75±0.06陰性組1.02±0.130.74±0.08干擾組0.52±0.041)0.22±0.061)F/P值38.984/0.00060.816/0.000

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.2SPOCK1敲低后降低膽囊癌細胞增殖和克隆形成能力 膽囊癌細胞中轉染SPOCK1 siRNA后，細胞A值、細胞克隆形成率明顯下降，而膽囊癌細胞中轉染siRNA control后對膽囊癌細胞A值和克隆形成率都沒有影響。SPOCK1敲低后可以明顯下調膽囊癌細胞增殖和克隆形成能力。見表2。

表2 各組膽囊癌細胞A值和細胞克隆形成率比較

2.3敲低SPOCK1促進膽囊癌細胞凋亡發生 對照組細胞凋亡率為〔(6.35±1.58)%〕,膽囊癌細胞中轉染SPOCK1 siRNA后，細胞凋亡率〔(22.17±3.54)%〕明顯升高，而膽囊癌細胞中轉染siRNA control后〔(6.82±1.65)%〕對膽囊癌細胞的凋亡沒有影響。SPOCK1敲低后可以明顯促進膽囊癌細胞凋亡。見圖2。

2.4敲低SPOCK1 促進膽囊癌細胞中Caspase-3活化并減少STAT3磷酸化 膽囊癌細胞中轉染SPOCK1 siRNA后，細胞中Cleaved Caspase-3水平升高，而p-STAT3水平下調，而膽囊癌細胞中轉染siRNA control后對膽囊癌細胞中Cleaved Caspase-3、p-STAT3水平沒有影響。SPOCK1敲低后可以明顯促進膽囊癌細胞中Caspase活化，抑制STAT3磷酸化。見圖3，表3。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測各組膽囊癌細胞凋亡

圖3 Western印跡測定各組膽囊癌細胞中Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3蛋白水平

組別Cleaved Caspase-3STAT3p-STAT3對照組0.37±0.041.06±0.140.58±0.06陰性組0.38±0.061.08±0.120.57±0.08干擾組0.93±0.111)1.06±0.070.21±0.031)F/P值53.428/0.0000.031/0.97036.688/0.000

3 討 論

SPOCK1最初發現于睪丸中，屬于一種嵌合多糖，因此被命名為睪丸蛋白聚糖1，后來隨著研究的不斷深入，SPOCK1存在于除了睪丸之外的組織中，因此也稱為Sparc/骨礦化結合素，其在多種物種中均有表達，是一個高度保守的多糖蛋白〔8，9〕。SPOCK1參與腫瘤的發生，與細胞與細胞之間的黏附作用有關，可以通過調控細胞內的基質金屬蛋白酶影響多種腫瘤的轉移〔10〕。已經有研究證實，SPOCK1在膽囊癌中表達上調，并且參與膽囊癌細胞的轉移和侵襲過程〔3，7〕。在肺癌中發現，SPOCK1表達水平異常升高，并且能夠調控肺癌細胞的生長，同樣在胃癌、膀胱癌等癌癥中發現SPOCK1異常高表達，并且與腫瘤預后、分期等有關〔11～13〕。近年來的研究顯示，神經膠質瘤細胞中沉默SPOCK1后，腫瘤細胞凋亡增多，SPOCK1還與腫瘤細胞的凋亡有關〔5〕。

細胞凋亡的發生是機體正常的生理功能的一部分，是清除細胞的主動途徑，當細胞凋亡途徑發生紊亂時，就會引起機體發育異常，出現多種疾病。腫瘤細胞的生長、凋亡與腫瘤的發生密切相關，腫瘤發生常常伴隨著腫瘤細胞凋亡異常減少的現象，如何誘導腫瘤細胞凋亡也是腫瘤治療的重要途徑〔14〕。Caspase-3以酶原的形式存在于細胞中，其N端含有一個較短的前區，沒有死亡效應結構域，必須通過活化后才可以促進細胞凋亡的發生，Caspase-3酶原中含有一個由3個天冬氨酸(ASP)組成的安全扣，當細胞凋亡發生時，這個安全扣在細胞質內裂解，在ASP內被剪切，形成活化形式的Cleaved Caspase-3，最終誘導細胞凋亡的發生，而Caspase-3介導的細胞凋亡過程幾乎存在于所有的腫瘤細胞中〔15～17〕。本實驗表明，SPOCK1沉默后可以誘導膽囊癌細胞的凋亡，促進細胞內Caspase-3的活化，減少膽囊癌細胞的增殖和克隆，SPOCK1沉默可以抑制膽囊癌的發展。

癌基因和抑癌基因參與腫瘤的發生，癌基因過度表達和抑癌基因表達減少是腫瘤發生的基礎。細胞的生長、增殖等與細胞內多種細胞因子和信號的轉導有關，是一個極為復雜的過程〔18〕。STAT3在腫瘤組織中異常激活，其激活后可以誘導腫瘤細胞的生長，減少腫瘤細胞凋亡〔19〕。研究顯示，膽囊癌組織中STAT3磷酸化水平異常升高，并且細胞內多種基因和藥物調控膽囊癌細胞的生長均與STAT3信號通路有關〔20～22〕。本研究提示SPOCK1沉默可能通過抑制STAT3信號通路影響膽囊癌細胞的生長和凋亡，其具體的作用機制還需要在以后進行驗證。

綜上，SPOCK1沉默可以減弱膽囊癌細胞的增殖和克隆能力，誘導Caspase-3介導的細胞凋亡，抑制STAT3信號通路的激活，SPOCK1沉默可以發揮抗膽囊癌生長的作用，而對于其分子機制尚不清楚，還需要在以后深入研究，為靶向SPOCK1治療膽囊癌提供堅實的參考。