葡萄糖氧化酶的應用及其在飼料中的作用機理

王佰濤，王一雯，許 杰，馬 煥，2，陳國參，劉德海，2

（1.河南省科學院生物研究所，河南鄭州450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南鄭州450008）

葡萄糖氧化酶（GOD）（EC1.1.3.4）是一種具有良好特性的需氧脫氫酶，能夠催化β-D-葡萄糖脫氫氧化生成葡萄糖內酯和過氧化氫，葡萄糖內酯會轉化為葡萄糖酸。目前葡萄糖氧化酶已經廣泛應用于飼料業和食品業的各個領域，其在化學、醫藥、紡織和其他生物技術領域中也有一些新穎的應用（Bankar等，2009）。

1 葡萄糖氧化酶的性質

葡萄糖氧化酶廣泛存在于自然界當中，其中微生物來源占絕大部分，主要是青霉和黑曲霉（Eremin等，2004）。高純度葡萄糖氧化酶為近白色或淡黃色粉末，易溶于水，幾乎不溶于有機溶劑。不同來源的葡萄糖氧化酶分子量也有所不同，一般為130～180 kDa。葡萄糖氧化酶對底物有較高的特異性，對β-D-葡萄糖的催化活性要遠遠大于α-D-葡萄糖，且底物中任一細微的結構改變都可能影響到催化活性。如果就酶促反應速率而言，以β-D-葡萄糖為底物的氧化速率作參考（100%），使用黑曲霉葡萄糖氧化酶時，只有2-脫氧-D-葡萄糖、4-O-甲基-D-葡萄糖、6-脫氧-D-葡萄糖的氧化速率能夠保持在較好的速率范圍內（10%～30%），當使用其他底物參與反應時，反應速率還不到β-D-葡萄糖氧化速率的2%（Leskovac等，2005）。

大多數酶的活性與活性位點中氨基酸的電離狀態息息相關，因此其所處的pH環境對活性影響很大。葡萄糖氧化酶的最佳pH為3～7，在pH高于7或者低于3時活性較低 （Sumaiyas等，2015）。大多數真菌或酵母菌來源的葡萄糖氧化酶在酸性至中性范圍內有最佳活性，例如黑曲霉和產黃青霉的最適pH為5～6（Kalisz等，1991）。但也存在少數真菌來源的葡萄糖氧化酶在偏堿性范圍內活性較好，例如繩狀青霉和變灰青霉葡萄糖氧化酶最適pH為6～8（Sukhacheva等，2004）。葡萄糖氧化酶在30～60℃活性較好，50℃左右活性最優，在溫度高于60℃或者低于30℃時活性較低。例如尼崎青霉葡萄糖氧化酶在40～60℃活性較好（Kalisz等，1991）。葡萄糖氧化酶還存在一些活性抑制劑如Ag+、Hg2+、Cu2+、羥胺、肼、苯肼、二甲酮和硫酸氫鈉等，這些金屬離子和化學物質的存在會抑制其活性（Nakamura等，1968）。孫丹等（2016）研究了銀離子誘導葡萄糖氧化酶結構的變化發現，銀離子會與葡萄糖氧化酶的輔基FAD結合進而影響其活性。

2 葡萄糖氧化酶的結構及催化機制

從結構上來說，葡萄糖氧化酶是一種含有黃素的糖蛋白，由兩個相同的80 kDa亞基組成，每個亞基含有一個黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其以黃素腺嘌呤二核苷酸為輔基，因而亦可稱為黃素蛋白或黃酶。每個葡萄糖氧化酶亞基都含有一個由四個α-螺旋支撐一個反平行的β折疊用來與底物結合。FAD輔基在葡萄糖氧化酶催化過程中充當氧化還原的電子載體，在反應中被還原為FADH2。研究發現大部分從微生物中得到的葡萄糖氧化酶含有約11%～13%甘露糖型的碳水化合物，其中絕大部分都是以氮苷和氧苷形式與酶的蛋白主鏈相連接（Nakamara等，1968）。

對葡萄糖氧化酶的三級結構研究表明，其活性部位由位于疏水口袋底部的FAD構成，此結構可與葡萄糖相結合，催化反應的中心是FAD異四氮嗪環的N-5位。酶的活性位點除了FAD外，還有三種與催化密切相關的氨基酸側鏈：His 516（pKa=6.9）、Glu 412（pKa=3.4）、His 559（pKa＞8）。Glu 412部分埋藏在蛋白質分子中，與His 559通過氫鍵連接，而His 516的側鏈更加靈活，更容易暴露在外，并且這些氨基酸殘基與葡萄糖氧化酶的反應速率密切相關（Leskovac等，2005）。

從催化機制上來說，葡萄糖氧化酶的催化反應不僅需要糖分子作為還原劑和電子供體，還需要氧化劑和電子受體共同完成催化反應。該反應可分為一個還原半反應和一個氧化半反應。在還原半反應中，首先葡萄糖與酶的結合會引起水分子從活性部位排出，葡萄糖C-1位置羥基的質子轉移至酶的堿性側鏈上（His 516），即后者發生質子化，葡萄糖被氧化為葡萄糖內酯，然后將C-1位置氫轉移至FAD異四氮嗪環的N-5位置，生成質子化的His 516和FADH2（Witt等，2000）。在氧化半反應中，第一步是氧氣擴散進入活性中心與FADH2發生接觸，接著還原型輔基FADH2被氧分子氧化為FAD，氧分子被還原為過氧化氫。這個反應是通過兩個單電子轉移完成，反應的中間產物是超氧陰離子自由基和黃素半醌自由基（Leskovac等，2005）。還原半反應和氧化半反應共同組成葡萄糖氧化酶的氧化還原體系。

3 葡萄糖氧化酶的應用

3.1 飼料 微生物飼料酶制劑作為一種飼料添加劑，能夠提高動物對飼料的消化利用，改善動物的代謝機能，近年來在飼料中應用廣泛。其中葡萄糖氧化酶于1999年7月26日被中華人民共和國農業部第105號文正式批準列入《允許使用的飼料添加劑品種目錄》，目前主要應用在家禽和家畜配合飼料中。

3.1.1 在家禽配合飼料中的應用 在家禽配合飼料中添加葡萄糖氧化酶可以提高家禽的產蛋性能，減少抗生素的使用量，降解飼料中的霉菌毒素，促進動物的生長。趙國先等（2007）研究表明，與對照組相比，試驗組飼料中添加0.1%～0.4%葡萄糖氧化酶后產蛋率得到提高，破軟蛋率有所下降，并且飼料中添加0.4%葡萄糖氧化酶能夠顯著增加白蛋白和血清總蛋白含量。湯海鷗等（2016）研究在飼料中添加不同劑量的葡萄糖氧化酶對肉雞生長性能的影響及替代抗生素的效果。結果表明，與對照組相比，試驗組肉雞全期日增重顯著提高，料肉比顯著下降；與添加正常量抗生素的對照組相比，添加酶制劑的試驗組肉雞的各項生長指標無顯著差異，說明用葡萄糖氧化酶替代抗生素來提高動物機體的免疫力效果顯著。并且研究發現葡萄糖氧化酶可以改善家禽肉質，降解飼料中的霉菌毒素和霉變飼料對動物的傷害。孫春陽等（2014）研究葡萄糖氧化酶和酵母硒復合添加劑對白羽雞抗氧化性能及肉質的影響，結果表明添加二者復合劑可以提高白羽雞抗氧化能力，改善雞肉肉質。湯海鷗等（2015）在肉鴨飼料中添加葡萄糖氧化酶探究其解除黃曲霉毒素B1的效果，結果發現葡萄糖氧化酶制劑能夠改善攻毒肉鴨的生長性能，降低攻毒肉鴨死亡率，說明葡萄糖氧化酶具有解除霉菌毒素的能力。

3.1.2 在家畜配合飼料中的應用 在家畜配合飼料中添加葡萄糖氧化酶可以提高對飼料的吸收利用率，促進家畜的生長。楊久仙等（2011）研究表明，在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠加強仔豬腸道酸性環境，改善腸道表面結構，提高對飼料的消化吸收率和利用率，促進仔豬的生長與發育。林謙等（2015）研究不同水平葡萄糖氧化酶替代氧化鋅對仔豬抗瀉的作用效果發現，與氧化鋅組相比，仔豬不僅腹瀉率降低，平均日增重也有所提高，總體效果強于氧化鋅。一頭母豬每年能夠生產的斷奶仔豬重量和斷奶仔豬數量是評價其生產性能的重要指標，研究證明葡萄糖氧化酶在提高母豬生產性能方面效果顯著。尤瑞祺等（2017）研究表明，在母豬妊娠后期的飼料中添加適當劑量的葡萄糖氧化酶可以提高母豬的生產性能及母豬和仔豬的抗氧化能力。葡萄糖氧化酶在促進家畜產后恢復和促進泌乳方面也卓有成效，劉亞娟等（2016）研究表明，飼料中添加0.4%的葡萄糖氧化酶可以顯著提高母兔泌乳性能，促進母兔產后體況的恢復。

3.2 食品 葡萄糖氧化酶可以在食品中作為液體或者粉末添加劑使用，并且常常被歸類為抗氧化劑或者防腐劑。在生鮮食品業，生鮮食品的新鮮程度主要取決于空氣中氧氣的影響。因此，除氧是保存生鮮食品的重要途徑，而目前市場上存在的一些化學性抗氧化劑會對人體的健康產生不利影響。葡萄糖氧化酶作為一種綠色健康的食品添加劑，能夠專一地消耗氧氣，阻止生鮮食品發生變質或者氧化，延長食品的保鮮期。例如蘋果汁當中含有許多酚類物質，在空氣中極易氧化加深為褐色，將葡萄糖氧化酶按0.4%添加量加入到蘋果汁中，可起到保鮮作用（王磊等，2018）。另外通過研究發現，葡萄糖氧化酶對海鮮食品及茶葉等的保鮮效果也十分顯著（徐德峰等，2017），能夠很好地保持食品的口感風味。當葡萄糖氧化酶用作食品包裝中的防腐劑時，如果發生包裝破裂或空氣泄漏，葡萄糖氧化酶和氧氣反應將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，導致pH下降，這樣可以根據包裝中pH條帶的變化來判斷包裝是否完整。某些特殊的包裝也允許少量空氣泄露，其原理是通過葡萄糖氧化酶產生少量的過氧化氫來抑制微生物的生長。

在面制品加工業中，加工面條過程中添加葡萄糖氧化酶制劑，可以顯著改善面團的強度和彈性，有效地提高面條的嚼勁，增加耐煮性（封雯瑞等，2000）。此外葡萄糖氧化酶對饅頭芯的硬度具有顯著地改善效果（林金劍等，2011）。作用原理是其反應過程產生的過氧化氫可以將面筋蛋白分子的巰基轉化為二硫鍵，增加了強度，提高面制品彈性（夏萍等，1999）。但如果葡萄糖氧化酶產生過多的過氧化氫就會對其催化活性產生抑制，因此食品級葡萄糖氧化酶制劑中通常會加入過氧化氫酶，以防止過氧化氫積累過多對葡萄糖氧化酶的活性產生影響（Bao等，2003）。

3.3 葡萄糖酸生產 葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖之后會產生葡萄糖酸，而葡萄糖酸及其衍生鹽在實際生產中應用十分廣泛，例如食品、紡織印染、金屬表面清潔、凝結劑、化妝品、藥品等，如作為食品添加劑，其可以用作食品中的酸度調節劑、膨松劑、抗氧化劑、螯合劑等（Brookes等，2005）。在工業上葡萄糖酸由發酵獲得，每年產量在五萬噸至十萬噸（Singh等，2005），但通過發酵過程來生產葡萄糖酸，時間長，投入大，并且發酵完成后分離程序復雜，生產成本太高。Lantero等（2001）用生物酶轉化法生產葡萄糖酸，發現轉化率已經能夠達到較高水平，不僅節約了發酵時間，也省去了復雜的分離除雜過程。盡管具有這些潛在的優勢，目前工業應用酶轉化法生產葡萄糖酸還比較少，說明在大規模應用之前還有許多困難要克服。

3.4 葡萄糖氧化酶傳感器 目前市場上存在的生物傳感器中，大多數是葡萄糖氧化酶生物傳感器，并且其主要基于固定化葡萄糖氧化酶。目前葡萄糖氧化酶傳感器可以應用在金屬離子、葡萄糖的濃度監測及醫學方面。例如汞離子在酸性環境通過與葡萄糖氧化酶的某些活性位點結合能夠抑制其活性，據此湯琳等（2005）通過聚苯胺膜制作葡萄糖氧化酶電極，然后用戊二醛交聯固定葡萄糖氧化酶，能夠完成酸性環境中對汞離子的含量測定，且不受其他重金屬離子的影響。張彥等（2009）通過應用殼聚糖包埋法將葡萄糖氧化酶固定到雞蛋膜上，制成葡萄糖氧化酶生物傳感器。此傳感器根據葡萄糖氧化酶消耗的葡萄糖和氧氣的正比關系，運用氧電極能夠將氧氣含量變化轉化為電信號，據此測定葡萄糖含量。在醫藥領域，通過刺破手指采血可以應用葡萄糖氧化酶傳感器檢測血糖濃度，但這種方法存在有創口、不能連續監測等缺點。目前開發的熒光式葡萄糖氧化酶傳感器能夠被應用于體內血糖濃度的連續監測，其原理是葡萄糖氧化酶輔基FAD氧化狀態的變化會影響葡萄糖氧化酶的熒光強度，然后通過監測葡萄糖氧化酶熒光強度的變化來監測血糖濃度（Brown等，2006）。與傳統的刺破手指采血相比，其具有能夠實現連續監測血糖濃度、無創口、反應靈敏等優勢。另外，在癌癥診斷方面，葡萄糖氧化酶傳感器能夠用于對某些腫瘤標志物的檢測，并且一些對應的癌癥治療策略也被開發出來（Fu等，2018）。

3.5 其他行業 目前葡萄糖氧化酶并不局限于上述應用。例如在紡織業中采用葡萄糖氧化酶環保型生物漂白工藝代替化學漂白具有良好的前景（王石磊等，2010）。化學漂白要求在堿性條件，且所需溫度也較高，而葡萄糖氧化酶生物漂白則可以在低溫中性條件下進行。這意味著這種處理方法能夠在能源和污水處理方面節省大量費用。在生物燃料電池方面，葡萄糖氧化酶用作催化劑的燃料電池是一種環保電池，能量轉化率較高，但目前技術并不成熟，需要對其進一步開發（呂豐等，2006）。

4 葡萄糖氧化酶在飼料中的作用機理

4.1 調節腸道微生物平衡，提高腸道消化能力葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖生成的葡萄糖酸呈酸性，可以降低腸道的pH，抑制有害菌群生長，促進有益菌群生長，并且葡萄糖酸能夠促進腸道中的食糜產生小分子有機物，為腸道有益菌的生長提供能量（Tsukahara等，2002），進而調節腸道微生物平衡。生成的過氧化氫具有廣譜的殺菌作用，研究表明其可以抑制大腸桿菌和沙門氏菌生長（Bankar等，2009），但這種抑菌能力和抗生素的作用機理不同，不會產生耐藥性，因此將其應用在畜牧業中屬于綠色養殖的發展方向。消化道pH的降低有利于消化酶原的激活，能夠促進動物產生促胰液素，提高胰酶水平，提高消化道的消化活性（冷向軍等，2002）。宋海彬等（2010A）研究表明，在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠提高肉雞腸道絨毛高度，降低腸道隱窩深度，改善腸道胰蛋白酶和淀粉酶的活性，提高腸道消化能力。

4.2 提高抗氧化能力 自由基存在于動物機體之內，如果積累過多會造成機體在分子及細胞水平的損傷，進而誘發各種疾病，葡萄糖氧化酶可以消耗氧氣產生過氧化氫，過氧化氫能夠刺激有益菌群產生過氧化氫酶，后者可以消除機體內的自由基，保護腸道上皮細胞，減少腸道損傷（胡常英等，2014）。血清中脂質過氧化物丙二醛的含量能夠反映機體清除自由基的能力，研究發現葡萄糖氧化酶能夠升高血清中超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提高動物機體的抗氧化能力。此外自由基的產生會影響精卵結合，影響動物的生產性能，清除自由基還可以提高動物的生產能力（尤瑞祺等，2017）。

4.3 改善生化指標 甲狀腺激素和生長激素能夠促進動物的代謝，增強蛋白質的合成，與動物的生長速度息息相關。研究發現葡萄糖氧化酶可以提高血清中有關激素如生長激素、碘甲狀腺原氨酸及甲狀腺素的含量，因此在飼料中添加葡萄糖氧化酶可以促進動物的生長（湯海鷗等，2015）。此外，肌酸激酶是存在于肌細胞中的一種特異性酶，血液肌酸激酶水平升高會增加家禽心肌、骨骼肌、腦組織病變的風險，而研究發現葡萄糖氧化酶能夠降低細胞膜通透性，抑制肌酸激酶從肌細胞進入血液，從而降低動物發生疾病的風險（趙國先等，2007）。

4.4 提高免疫力 研究發現葡萄糖氧化酶可以提高動物的免疫力（Wang等，2018），提高免疫球蛋白IgA水平（宋海彬等，2010B），減少抗生素的使用。例如在母豬妊娠后期，由于胎兒快速生長容易在體內累積大量自由基，產生炎性因子，會降低免疫球蛋白水平，從而降低動物機體的免疫力，通過在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠減少免疫力低下胎兒的出現。此外，在飼料中添加葡萄糖氧化酶之后，腸道中的有益菌群增多可以提高動物機體的特異性和非特異性免疫，進而提升機體的免疫防御能力（劉輝等，2010）。

5 結語與展望

葡萄糖氧化酶作為一種綠色環保的酶制劑，對機體無毒害作用，在飼料中應用能夠改善動物生長性能，提高畜牧業產值，在食品中應用可以改善口感，延長保鮮時間，并且在生物燃料電池等新興產業中也具有廣泛的應用前景。但目前葡萄糖氧化酶的產量和質量仍然有待提升，下一步希望通過基因工程技術能夠不斷提高酶的活力和表達量，其潛在利用價值仍有待進一步開發。