高效液相色譜法測定面條中過氧化苯甲酰的含量

孟 霞，丁臘梅，周 帥，阮曉玲

（長沙醫學院藥學院，湖南長沙 410219）

過氧化苯甲酰（BPO）是面粉中常見的添加劑，能抑制面粉中一些微生物生長，增強面筋彈性和增加面粉的白度，起到漂白和防止霉變的作用[1]，常被稱為面粉增白劑。BPO具有很強的氧化性，性質極不穩定，在面條加工的過程中絕大部分會水解成苯甲酸，其對面食具有后熟作用[2]，但苯甲酸超過限度可能導致肝、腎臟損害[3]，影響人體健康。我國食品標準GB 2760中規定了小麥粉中過氧化苯甲酰的限度為0.06 g/kg[4-5]，衛法監發[2001]159號文，以及國家質量監督檢驗檢疫總局發布的GB/T 18415—2001均規定了面粉中過氧化苯甲酰的檢驗方法。我國已于2011年撤銷過氧化苯甲酰作為食品添加劑的許可，嚴禁在面粉生產中添加過氧化苯甲酰，同時加強了小麥及其產品的監督力度，以保障該類食品的食用安全。

目前，過氧化苯甲酰的檢測方法包括化學分析法、光譜法[6]、色譜法[7-8]和質譜法[9]等，其中化學分析法和光譜法由于靈敏度較低，不適用低限度過氧化苯甲酰的檢測。食品標準和多數文獻研究均采用高效液相色譜法對面粉及面食產品中的過氧化苯甲酰進行測定，該法又分為直接法和間接法，但是過氧化苯甲酰化學性質不穩定，易分解生成苯甲酸，將樣品中過氧化苯甲酰還原為苯甲酸后，采用間接法測定過氧化苯甲酰更為可靠。

試驗采用HPLC法測定面條中過氧化苯甲酰含量，將過氧化苯甲酰分解為苯甲酸，通過測定面條中苯甲酸的量間接測定過氧化苯甲酰的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-P600型依利特液相色譜儀、AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；KQ-300E型超聲儀，昆山超聲儀器有限公司產品。

過氧化苯甲酰標準品（99.0%，B802244-250 g）、苯甲酸標準品（＞98%，B20085-250 g），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸（85%），超純水，硫代硫酸鈉（分析純），面條。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Hedera-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；采用乙腈-0.04%磷酸（42∶58，V∶V） 作為流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長235 nm，進樣量為20μL。

1.2.2 苯甲酸和過氧化苯甲酰對照品溶液

精密稱取苯甲酸和過氧化苯甲酰對照品各約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密移取0.1 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻即得10.0μg/mL的對照品儲備液。

1.2.3 供試品溶液

精密稱取8.0 g粉碎后的面條粉末，置于25 mL容量瓶中，加入10 mL無水乙醇，再加入1.0 mL 10%Na2S2O3溶液，超聲時間15 min，放置5 min后用流動相定容至刻度，混合均勻，靜置，取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，備用。

1.2.4 色譜圖

過氧化苯甲酰對照品溶液見圖1，苯甲酸對照溶液見圖2。

由圖1和圖2可知，過氧化苯甲酰在常規前處理過程中會分解為苯甲酸，很難直接測定面條中的過氧化苯甲酰。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

精密移取苯甲酸對照品儲備液適量，分別配制質量濃度為0.1，0.3，1.0，5.0，10.0μg/mL苯甲酸對照品溶液，分別精密吸取上述溶液20μL，注入液相色譜儀中，記錄峰面積。以苯甲酸對照品溶液質量濃度（μg/mL） 為橫坐標、苯甲酸峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=16 332X+2 512.4，R2=0.999 7，結果表明苯甲酸的質量濃度在0.1～10.0μg/mL的線性關系良好。

圖1 過氧化苯甲酰對照品溶液

圖2 苯甲酸對照溶液

2.2 精密度

取面條粉末8.0 g，精密稱量，置于25 mL容量瓶中，精密移取0.25 mL 10.0μg/mL過氧化苯甲酰對照溶液，然后按照“供試品溶液配制”項下方法進行處理，精密吸取上述溶液20μL進樣分析，連續進樣6次。

精密度試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果

分析計算可得，測得的樣品中苯甲酸質量濃度均值為0.105μg/mL（相當于0.33 mg/kg），乘以系數0.992（MBPO），即樣品中過氧化苯甲酰含量為0.104μg/mL（相當于0.32 mg/kg），RSD為5.21%，樣品精密度符合要求。

2.3 準確度

取湖南某公司生產的面條，粉碎后稱取約8.0 g置于25 mL容量瓶中，制備9份，分別加入0.25，0.75，2.50 mL過氧化苯甲酰對照品儲備液（10.0μg/mL），每個質量濃度水平配制3份，按“樣品制備”項方法制備低、中、高3個質量濃度水平的加樣回收率樣品溶液，相同色譜條件下測定。

加樣回收率試驗結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.4 LOD和LOQ

以信噪比（S/N） 為3和10分別計算檢測限和定量限，過氧化苯甲酰的最低檢出限和定量限分別為0.03μg/mL和0.1μg/mL。

2.5 穩定性

配制0.1μg/mL過氧化苯甲酰溶液和苯甲酸對照溶液，2份溶液分別放置0，0.5，1.5，3.0，5.0，8.0，10.0，12.0 h后進樣分析，記錄色譜峰面積，二者的RSD分別為1.31%和1.68%，表明2種溶液在12 h內基本穩定。

2.6 樣品測定

分別取3個不同廠家的面條，按“供試品溶液項”下制備樣品溶液，分別進樣分析。3個公司生產的面條均不含過氧化苯甲酰添加劑，產品合格。

樣品測得結果見表3。

表3 樣品測得結果

3 討論

3.1 樣品前處理

與之前的研究報道相比，試驗樣品的取樣量增加較多，對前處理方法進行了優化，文獻報道的前處理方法包括振蕩、渦旋和超聲[10-12]等，比較這3種前處理方法對過氧化苯甲酰生產苯甲酸的轉化率，稱取8.0 g面條粉末，分別制備含有0.1μg/mL和10.0μg/mL的過氧化苯甲酰樣品溶液進行考查，加入相同量的硫代硫酸鈉溶液，常溫條件下反應時間也相同。

3種前處理方法過氧化苯甲酰的轉化率結果比較見表4。

由表4可知，硫代硫酸鈉溶液與過氧化苯甲酰反應，超聲的前處理方法比渦旋和振蕩的轉化率明顯要高，超聲處理15 min后，反應時間對過氧化苯甲酰的轉化率的影響不大，最終選擇過氧化苯甲酰與硫代硫酸鈉溶液在常溫條件下超聲處理15 min作為試驗前處理方法。

表4 3種前處理方法過氧化苯甲酰的轉化率結果比較

3.2 Na2S2O3用量

稱取8.0 g面條粉末，分別制備含有0.1μg/mL和10.0μg/mL的過氧化苯甲酰樣品溶液，其中分別加入不同體積（0.5，1.0，1.5，2.0 mL） 的10%硫代硫酸鈉溶液進行還原，通過比較過氧化苯甲酰生成苯甲酸的轉化率，最終選擇1.0 mL 10%硫代硫酸鈉溶液作為還原劑。

3.3 過氧化苯甲酰的限度

我國食品添加劑使用衛生標準GB 2760—1996規定了過氧化苯甲酰在小麥粉中的限度為0.06 g/kg[4-5]；許秀敏等人[13]采用HPLC同時測定小麥粉及其制品中過氧化苯甲酰和苯甲酸，BPO的檢出限可達到0.10 mg/kg；張艷等人[14]采用高效液相色譜法同時測定面粉中的過氧化苯甲酰和苯甲酸，BPO的最低檢出限為0.14 mg/kg；邢文[15]在小麥粉中過氧化苯甲酰檢測色譜法改進中，BPO的檢出限為0.005 g/kg；晏龍等人[10]在HPLC法測定面粉中曲酸和過氧化苯甲酰的含量中，BPO的檢出限為0.5μg/g；試驗也采用HPLC法測定面條中過氧化苯甲酰的含量，最低檢測限為0.093 7 mg/kg，遠遠低于食品添加劑使用衛生標準的0.06 g/kg，也低于其他文獻報道的限度，方法靈敏度更高，適用于面條中低限度過氧化苯甲酰含量的測定。

4 結論

研究針對不同生產廠家加工的面條，通過優化樣品前處理條件，建立了間接測定面條中過氧化苯甲酰的高效液相色譜方法。該方法操作簡單快捷、靈敏度和準確度高，適用于實際工作中面條中過氧化苯甲酰的測定，方法具有一定的優勢。