β樣淀粉蛋白和早老素增強子-2與環磷酸腺苷應答原件結合蛋白的關系

邸暢 李國萍 陳紹春，3

(昆明醫科大學 1基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，云南 昆明 650500；2第三附屬醫院頭頸外科；3康復學院)

β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是阿爾茨海默病(AD)公認的一個病理學改變也是診斷依據之一。γ分泌酶是產生Aβ的最后剪切蛋白復合體，它剪切生成的Aβ主要為Aβ40和Aβ42。而比較認可的形成Aβ沉積的原因就是Aβ40和Aβ42比例的失調。γ分泌酶中起主要催化作用的部分是早老素(PS)-1，而早老素增強子(Pen)-2主要作用就是使PS-1內分解，對底物的催化作用產生影響。環磷酸腺苷應答原件結合蛋白(CREB)是與長期記憶和基因轉錄密切相關的一種蛋白，單體Aβ42可以促進其生成，而CREB本身可以調節Pen-2表達。本文就Aβ的形成意義、CREB的前后作用、Pen-2的功能對三者間的關系進行綜述。

1 Aβ的形成

淀粉樣前體蛋白(APP)在經過β分泌酶切割的情況下形成99個氨基酸的肽鏈(C99),C99在γ分泌酶剪切后形成Aβ40和Aβ42，Aβ40和Aβ42的區別在于Aβ42羧基端多了2個疏水鍵，導致Aβ42更容易積聚沉積形成淀粉樣斑塊〔1〕。在腦中形成的Aβ斑塊會對神經元產生毒性作用導致神經損傷甚至腦萎縮，而Aβ寡聚體很可能是淀粉樣斑塊的前體〔2〕。Aβ寡聚體可能通過降低CREB靶基因和腦源性神經營養因子(BDNF)的表達而損害AD中的神經元功能。恰恰相反的是新的研究發現Aβ42單體可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路誘導分化型人神精母細胞瘤和元代大鼠皮層神經中CREB的激活,而Aβ42寡聚體沒有這個影響,反而在大鼠模型和AD患者中CREB的表達受損〔3〕。這說明單體和寡聚體之間的轉變是毒性作用產生的原因。Aβ40與Aβ42的比例失常被認為是導致淀粉樣沉淀的原因，Aβ40在AD發病機制中具有保護作用。雖然已知Aβ40能抑制Aβ42纖維的形成，但尚不清楚這種抑制作用是對無毒單體起作用，還是對毒性寡聚體起作用。有研究通過核磁信號來監測Aβ42和Aβ40單體的變化，差異核磁共振同位素標記可以選擇性地觀察Aβ42在Aβ42和Aβ40混合物中的聚集狀況〔4〕。Aβ40單體通過Aβ42/Aβ40比例依賴的方式抑制無毒Aβ42單體的聚集。核磁共振測定表明，Aβ40單體與Aβ42寡聚體的結合比Aβ42單體具有更高的親和力。Aβ40還可以從Aβ42寡聚體中釋放Aβ42單體〔4〕。另有研究發現，構成纖維的Aβ分子不斷地解離和再結合，從而導致纖維群內的分子循環〔2〕。對Aβ40和Aβ42的研究表明，構成Aβ40的分子比Aβ42的再循環程度要大得多〔2〕。這在側面也說明了Aβ40在與Aβ42的作用中起到一個保護Aβ42不聚集沉積的作用，當這種比例失調發生的時候單體Aβ40的量不能維持可以使單體Aβ42游離的程度，Aβ的寡聚體就形成了，而惡性循環下毒性斑塊的形成也只是時間問題。Aβ42有4種形態，分別為單體、寡聚體、原纖維和纖維，其中Aβ42單體和纖維是沒有神經毒性的，寡聚體的毒性最大，原纖維的毒性反而降低〔5〕。在過去的研究中有針對小膠質細胞和星形膠質細胞對Aβ寡聚體吞噬的研究，筆者推斷正常情況下當Aβ42寡聚體形成過多時被小膠質細胞和星形膠質細胞吞噬是正常的代謝過程。而上述的膠質細胞對纖維的吞噬能力比對寡聚體的吞噬能力弱得多，即當Aβ寡聚體形成過量而無法代謝時，沉淀形成斑塊的可能性將大幅增加。

2 CREB

CREB在大腦中的所有細胞中都有表達，CREB最著名的是它參與學習和長期記憶的形成，是作為轉錄因子發揮作用的蛋白質家族中的一員。轉錄因子(如CREB)對刺激轉錄耦聯起著至關重要的作用。將發生在細胞膜上的事件傳遞給基因表達的改變。反過來，改變基因表達，通過調節幾乎所有類型的神經元蛋白的表達，最終會影響單個神經元和整個神經元回路的功能。CREB介導的基因轉錄的關鍵步驟包括二聚，與DNA中的反應元件結合及磷酸化。近年來的研究表明，老年人非病理性記憶障礙與信號轉導異常有關〔6〕。CREB轉錄因子家族的成員包括轉錄增強子(如CREB1)和抑制子(如CREB2)，并與許多信號蛋白相互作用，介導從短期記憶到長期記憶的轉變。用定量Western印跡法測定6月齡和24月齡大鼠海馬勻漿中CREB1和CREB2的含量，根據空間記憶能力，將老年大鼠分為兩組：年齡無損傷大鼠(AU)在青年(Y)得分的范圍內，而老年受損大鼠(AI)的范圍內得分不在該范圍〔6〕。總體而言，老年大鼠CREB1蛋白明顯低于青年大鼠。實驗分析表明，這一差異是由于老年損傷大鼠的CREB1水平顯著下降，而老年未受損大鼠的CREB1水平與年輕大鼠相當，幼年大鼠和老年大鼠CREB2蛋白水平無明顯變化〔6〕。這些結果表明CREB1蛋白的調控失調可能是導致部分老年人空間記憶障礙的原因之一。另有研究〔7〕絲氨酸(Ser)133上轉錄因子CREB的磷酸化參與了海馬依賴任務的長期記憶的建立，大鼠接受海馬內輸注單純皰疹病毒(HSV)-mCREB(一種突變型CREB，其中Ser133已被丙氨酸取代)、HSV-β半糖苷酶結構基因(Lacz)或生理鹽水，3 d后接受訓練。訓練后立即短期試驗和11 d長期試驗檢測大鼠的食物偏好(示范食物與新型食物)。在短期記憶測試中，所有治療組的大鼠對已證實的食物有明顯的偏好。然而，在長期記憶測試中，經mCREB處理過的大鼠所吃食物的百分比明顯低于經Lacz或鹽水處理的大鼠。定量Western印跡證實mCREB注入大鼠訓練組的海馬CREB蛋白含量明顯高于對照組〔7〕。接下來的研究中通過病毒介導的基因轉錄來增加海馬背側的CREB水平，在水迷宮實驗中與鹽水組和Lacz組相比增加海馬背側CREB表達組長期記憶明顯增強，需要記住的時間明顯縮短〔8〕。在紋狀體中增加突變CREB的表達與鹽水組和Lacz組相比并沒有同樣的反映記憶時間上的節省，說明背側紋狀體在反應記憶的形成中起重要作用〔9〕。BDNF是CREB轉錄表達后的產物，已被證明是長期記憶產生的一個關鍵因素。在海馬背側CA1區注射重組BDNF可逆轉局部抑制蛋白質合成所造成的記憶持續缺陷。重要的是，BDNF能夠通過一種胞外調節蛋白激酶(Erk)依賴機制將一條永久的長期記憶軌跡轉化為一種持久的記憶軌跡，從而誘導記憶的持久性。BDNF不僅是必需的，而且足以在海馬內誘發一個后期的記憶處理階段，這對于長期記憶儲存的持續存在是必不可少的〔10〕。在AD模型Tg2576基因突變小鼠腦組織免疫組化分析顯示海馬和皮層CREB水平降低，轉基因小鼠腦組織中檢測到氧化應激標記物，顯示星形膠質細胞豐富的區域CREB染色減少〔11〕。在AD患者病死后海馬標本中，十二烷基硫酸鈉(SDS)提取的Aβ與CREB蛋白水平也呈負相關〔11〕。CREB調控的BDNF和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制劑BIRC-3的水平降低，Caspase-9的活性裂解形式(凋亡的內在途徑)升高。大鼠原代海馬神經元暴露于Aβ纖維后，CREB啟動子活性降低。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可逆轉Aβ導致的神經元CREB mRNA水平下降。腺病毒介導CREB過度表達對Aβ誘導的神經元凋亡有明顯的保護作用〔11〕。也就是說長期記憶形成的部位是在Aβ斑塊沉積易形成的海馬區，而CREB的生成可以被單體Aβ42所激活，Aβ的寡聚體可降低CREB的表達。

3 Pen-2

Pen-2是組成γ分泌酶復合體的一部分，與Ps-1、呆蛋白(Nct)、前咽缺陷蛋白(Aph)-1行成復合體，在Aβ的形成和Notch刻痕信號通路中起作用〔12〕。γ分泌酶起催化作用的主要部分是Ps-1，也是γ分泌酶抑制劑的主要作用部位〔13〕。而Nct除了支持和穩定作用外還能對γ分泌酶切割的底物起識別作用。但是當敲除Nct的情況下γ分泌酶的功能不受影響，也說明了Nct在γ分泌酶中不是必需的〔14〕。值得注意的是，PEN-2的羧基端親水結構域可以促進Ps-1的內源性水解，但對穩定Ps-1的衍生物至關重要。更重要的是，由甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1中的跨膜區(TMD)1取代Pen-2的TMD2的嵌合是完全有功能的，而用SREBP-1中的TMD2替換Pen-2的TMD2的嵌合則不是這樣。后一種嵌合體的功能是通過將SREBP-1的TMD2近端2/3替換為PEN-2中真實的TMD1的近端2/3來挽救的。這些結果表明，近端2/3的Pen-2 TMD1在功能上對Ps-1全蛋白的內源性分解和Ps-1片段的產生具有重要的作用〔15〕。在一定的PS1、N端氨基端(NTF)/C端羧基端(CTF)表達水平下，Aβ的產生是可飽和的，而Pen-2的過度表達則進一步增加了Aβ的產生。雖然Pen-2并不能促進PS1-NTF/CTF異二聚體的形成，但PEN-2的表達降低了一種過渡態類似物γ-分泌酶抑制劑的半抑制率(IC50)，表明Pen-2的表達增強了底物與催化位點的親和力或降低了閾值〔16〕。有研究對人源Pen-2基因的上游區域進行了鑒定，并將位于翻譯起始密碼子上游353 bp的238 bp片段作為啟動子活性的關鍵區域。進一步分析發現，CREB結合位點位于238 bp區域，該區域對Pen-2啟動子的轉錄活性至關重要。CREB位點突變阻斷了Pen-2啟動子的轉錄活性。電泳遷移率測定和染色質免疫共沉淀分析表明，CREB在體外和體內均與Pen-2啟動子區結合。用CREB激動劑福斯克林(Forskolin)激活CREB轉錄因子可顯著促進Pen-2 mRNA和蛋白的表達，而對γ-分泌酶復合物的其他組分沒有影響〔17〕。當Ps-1基因突變導致Ps-1和Pen-2聯系減少但不影響γ分泌酶功能和Ps1內分解時，Aβ42∶Aβ40比例升高且不影響Notch信號通路，即當Pen-2表達量降低時Aβ42∶Aβ40升高〔18〕。而在癡呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制劑時加重了小鼠的記憶障礙，這也從側面說明了Aβ42可能在記憶形成中具有重要作用〔19〕。在過去的報道中有研究通過構建一個攜帶人源PEN-2的雜交基因，并將其用于人神經上皮細胞的轉染，該細胞還與突變體早老素2(hPS2m)和瑞典突變型Aβ前體蛋白(APPsw)共轉染。結果表明：(1)人源PEN-2過表達可引起γ分泌酶活性及其蛋白(包括Ps1-CTF、Aph-1和Nct)的增加，從而產生Aβ42的量增加；(2)與hPS2m和APPsw共轉染對γ分泌酶蛋白的誘導和活性的影響并與單獨轉染hPen2相比作用差異不大；由此可見底物和催化活性對于Aβ42的產生并不是必須的〔20〕。但Aβ42的增加作者并未說明Aβ40的變化，而Aβ42與Aβ40的比例變化對Aβ寡聚體和淀粉樣沉積的形成有重要意義。綜上所述，突變激活Pen2上游CREB結合位點時可增加Pen2蛋白和mRNA的表達，過表達Pen2可增強γ分泌酶及Aβ42的表達，而PS-1及Pen-2的聯系減少時即Pen-2表達降低時Aβ42∶Aβ40增加，可以看出Pen2對Aβ42和Aβ40的產生具有調節的作用，但是當Pen-2增加時對Aβ42∶Aβ40是未知的，此時雖然Aβ42的量增加但不能說明比例是否失衡及有無淀粉樣蛋白的產生。

4 總結和展望

綜上，當CREB的表達下降，Pen-2的表達量將受到直接的影響隨之下降，Aβ42與Aβ40的比例增加。當Aβ40單體的量不足以維持Aβ42單體形式，產生Aβ寡聚物甚至沉積而導致CREB的表達進一步受損，形成一個正反饋的閉環。值得繼續研究的是，當Pen-2表達量增加時隨之增加的Aβ42是否同時伴隨著更多的Aβ40的增加、而Aβ40的增加能否真正有效可觀的減少Aβ寡聚體甚至沉淀的形成是未來要研究及努力的方向。