單倍體胚胎干細胞研究概述

黃宇航 陳伶莉 胡雪峰

(福建師范大學生命科學學院 福州 350108)

單倍體胚胎干細胞(haploid embryonic stem cells， haESCs)是指只含有一套染色體，但具有類似于正常干細胞分裂與分化能力的細胞群。根據誘發方式不同，單倍體胚胎干細胞主要分為兩類： 孤雌單倍體胚胎干細胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cells， PG-haESCs)和孤雄單倍體胚胎干細胞(androgenetic haploid embryonic stem cells， AG-haESCs)。近年來，單倍體胚胎干細胞研究領域取得了一系列突破性成果。本文對單倍體胚胎干細胞的研究進展進行概述。

1 單倍體胚胎干細胞及其研究意義

哺乳動物的所有體細胞正常情況下均為二倍體，分別來自父方和母方，當外界因素影響導致基因突變時，二倍體的基因組可減小突變帶來的不利影響；雙親兩套染色體的選擇性表達，使后代表現型呈現出多樣性，有利于個體進化。然而，不同于二倍體細胞，單倍體細胞只有一套染色體，這大大降低了基因組的復雜程度，使其成為遺傳學和基因組學研究的重要工具。在哺乳動物體內，有兩類細胞處于單倍體狀態，它們分別是減數分裂后的生殖細胞和某些癌細胞。生殖細胞功能高度特化，且難以在體外進行長期培養、擴增，也很難對其進行基因操作與篩選。從癌細胞中分離出的接近單倍體的異倍體細胞系雖然能夠穩定培養，但此類細胞系的非整倍體性限制了其在基因研究及疾病治療方面的應用。

近年來，隨著小鼠單倍體胚胎干細胞系的成功建立，單倍體胚胎干細胞的基因功能研究已經從細胞水平提升到了機體水平。盡管如此，單倍體細胞自發二倍化[1]、哺乳動物基因印記狀態的維持[1～4]、實驗動物遺傳背景的選擇[3]以及物種差異的影響，都給單倍體胚胎干細胞系的建立與進一步的研究帶來了巨大的挑戰。

2 單倍體胚胎干細胞系的建立

植物單倍體的研究始于1972年，Gupta和Carlson首次建立了煙草單倍體細胞系。之后，單倍體細胞系在不同種類的高等植物中陸續建立。然而，動物單倍體細胞系的建立則顯得困難重重。2009年，Yi等[5]成功建立青鱔魚穩定的單倍體胚胎干細胞系，并將該單倍體胚胎干細胞的細胞核移植到正常未受精的卵細胞中，通過生殖系嵌合得到半克隆后代。這里所提到的半克隆后代指的是由一方單倍體源性基因和另一方單倍體源性基因相互結合形成的、擁有正常染色體數的、胚胎發育成的后代。哺乳動物單倍體胚胎干細胞在培養過程中會出現自發的二倍體化現象，再加上受單倍體細胞分離技術的制約，哺乳動物單倍體胚胎干細胞系的建立直到2011年才有所突破[6，7]，這一成果將單倍體胚胎干細胞的研究推向新的高度。

2.1 孤雌單倍體胚胎干細胞系的建立 建立孤雌單倍體胚胎干細胞系的關鍵在于未受精的卵母細胞如何在體外被“激活”產生“干細胞特性”。研究發現，可以通過物理(電脈沖)和化學方法(乙醇、細胞松弛素、離子霉素等)或兩種方法的交互應用模擬受精時卵母細胞內的鈣震蕩，從而實現未受精卵母細胞的激活并完成減數分裂，獲得孤雌囊胚。隨后，用化學免疫法去除孤雌囊胚的滋養層得到內細胞，將其接種在以γ射線或絲裂霉素C處理的飼養層上，用干細胞培養液培養[6，7]。傳代過程中，將干細胞團塊用消化酶打散成單個細胞后染色，并定期分選富集，從而最終建立起孤雌單倍體胚胎干細胞系。

2011年，英國科學家Leeb與Wutz[6]和奧地利科學家Elling等[7]采用流式細胞分選技術，成功地從小鼠孤雌發育的單倍體胚胎中建立了小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞系。如今，單倍體胚胎干細胞的研究已經推廣到人類。2016年，Sagi等[8]成功建立了擁有干細胞典型特征的人單倍體胚胎干細胞系。Zhong等[9]也通過顯微操作去除人受精卵中的雄原核的方法，建立了孤雌胚胎，高效得到了兩個人單倍體胚胎干細胞系。

2.2 孤雄單倍體胚胎干細胞系的建立 孤雄單倍體胚胎干細胞的獲得較復雜，其與孤雌單倍體胚胎干細胞的主要區別在于： 進行激活之前還需先建立帶有雄性基因組的“卵細胞”，主要通過向去核的卵母細胞中注入成熟精子頭部和除去受精卵中雌原核這兩種方法[3]。

2012年，Li[2]和Yang[3]的研究團隊利用這兩種方法分別建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞系。研究證明，這類孤雄單倍體胚胎干細胞保留了精子攜帶的父源印記，能夠替代精子與卵細胞，形成與受精卵相似的二倍體胚胎。2014年，Li[10]的研究團隊再次宣布成功建立了大鼠孤雄單倍體胚胎干細胞系。

3 單倍體胚胎干細胞的分化潛能

3.1 孤雌單倍體胚胎干細胞的分化潛能 在培養過程中，科學家已經發現小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞可以產生正常形態的胚狀體并具有多向分化能力，同時還發現了其關鍵的多能標記基因的表達[6，7，11]。令人驚訝的是，后續隨著人類單倍體胚胎干細胞系的建立，已有研究表明，與小鼠單倍體胚胎干細胞相比，人類單倍體胚胎干細胞更容易分化成所有三胚層，且仍能保持單倍性[8，9，12]。

3.2 孤雄單倍體胚胎干細胞的分化潛能 Yang[3]等通過類似的方式證明了孤雄單倍體胚胎干細胞具有生殖分化能力，且在E12.5d的嵌合胚生殖嵴中檢測到了孤雄單倍體胚胎干細胞的存在。然而，在實驗中也發現，相較于孤雌單倍體胚胎干細胞，孤雄單倍體胚胎干細胞分裂過程中更容易發生二倍化。

4 單倍體胚胎干細胞的遺傳與表觀遺傳學特性

4.1 遺傳學特性 通過流式細胞分析單倍體胚胎干細胞系中DNA的含量，發現無論是孤雌還是孤雄單倍體胚胎干細胞系，它們在有絲分裂G1期都含有1n倍的染色體，而在有絲分裂G2期則變為2n倍。值得注意的是，在孤雄單倍體胚胎干細胞系中的性染色體均只含一條X染色體，推測可能是由于Y染色體缺乏部分基因序列，導致僅攜帶Y染色體的孤雄單倍體胚胎干細胞發育異常，難以存活。2012年，Li[3]的研究團隊利用孤雄單倍體胚胎干細胞代替精子與卵細胞完成“受精”作用，進而獲得存活且可育的半克隆小鼠后代，同時發現這些能夠成功存活的半克隆小鼠都是雌性。

4.2 表觀遺傳學特性 哺乳動物發展形成了基因組印記調控，所以哺乳動物單倍體胚胎干細胞的印記模式是其最重要的表觀遺傳學特性。基因組印記是指某個基因的等位基因根據親本來源不同而有不同的表達，分為母源印記和父源印記，所以對應的單倍體胚胎干細胞分為孤雄單倍體胚胎干細胞和孤雌單倍體胚胎干細胞，其中主要的父源和母源印記基因分別是母系表達的印記基因(imprinted maternally expressed transcript，H19)和胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2)。正常的基因組印記是哺乳動物發育的基本條件，但在體外培養單倍體胚胎干細胞的過程中基因組的印記狀態可能會發生改變，從而影響胚胎外膜和滋養層的正常發育，導致成活率降低，研究人員推測這可能與基因印記非甲基化有關[13]。基因印記的分子機制尚未完全明確，目前大多認為是DNA甲基化，甲基化通常抑制基因的表達，且富含CpG的差異性甲基化區域(differential methylation region， DMR)就是印記的修飾位點[14]。已經有許多研究表明，通過基因敲除的方式能夠解決基因印記非甲基化的問題，并提高半克隆小鼠的成活率。

2004年，Kono等[11]利用H19和H19DMR完全敲除的non-growth卵，成功得到了孤雌來源的成年動物。隨后又證實，如果進一步敲除小鼠12號染色體上的基因間區的差異甲基化區域(intergenic differentially methylated region， IGDMR)，能夠將孤雌小鼠的發育效率提高30%。Zhong等[15]也嘗試利用規律成簇的間隔短回文重復序列/核酸內切酶9(CRISPR-Cas9)技術制備H19DMR和IGDMR的雙敲孤雌胚胎干細胞，并注入第二次減數分裂中期的卵母細胞，同樣也較高效地獲得了健康的半克隆小鼠。2012年，Zhong等[4]利用H19DMR和IGDMR的雙敲除孤雄單倍體胚胎干細胞系，使產生健康半克隆小鼠的效率達到了22.3%，較之前Yang等[1]的研究結果提高了10倍。

5 單倍體胚胎干細胞的應用

單倍體胚胎干細胞在分子水平有著比較大的應用價值，能夠廣泛用于正向和反向遺傳學研究，將CRISPR-Cas9技術與單倍體胚胎干細胞系的建立結合，就可以實現大規模的基因編輯，從而建立單倍體細胞突變文庫。在細胞水平，單倍體胚胎干細胞的基因篩選可用于研究疾病表型與治療、藥物作用機制以及疾病發病機制等。研究發現，這些單倍體胚胎干細胞即使經過復雜的基因編輯操作，仍然能夠維持其單倍性和多能性的特點。相比于精子與卵子來說，單倍體胚胎干細胞的結構與功能未發生特化，所以在體外能長期穩定培養與擴增，同時也可以對其進行基因操作和篩選。所以在個體水平，經基因改造的孤雄、孤雌單倍體胚胎干細胞可代替精子和卵子[13]，從而得到轉基因半克隆小鼠，此方法極大地縮短了制備轉基因小鼠的實驗周期。Li等[2]利用CRISPR-Cas9技術已經成功獲得了世界上首個由基因修飾的單倍體胚胎干細胞“受精”發育而成的健康轉基因小鼠。CRISPR-Cas9技術的發展及其與單倍體胚胎干細胞的結合應用，提供了一種能夠在短時間內建立攜帶可遺傳基因修飾的轉基因動物的新途徑[2]。當然，利用單倍體胚胎干細胞不僅能獲得基因修飾動物，還能利用單倍體胚胎干細胞實現同性生殖、研究物種間雜交。

人類單倍體胚胎干細胞系的建立為研究人類基因組功能以及發育機制提供了新穎的方式，也為生物醫學的各種應用帶來了新的曙光[12]；然而，由于涉及倫理問題，人單倍體胚胎干細胞在基因缺失研究方面的應用僅限于細胞水平。

6 結論與展望

單倍體胚胎干細胞具有多能性，能夠在體外誘導分化成為不同類型的細胞，在癌癥研究、再生醫學和疾病建模等領域都具有重要的應用價值。但是，目前在單倍體胚胎干細胞的研究過程中還存在著許多問題，如單倍體胚胎干細胞容易發生二倍化以及半克隆小鼠的出生率低下等。此外物種差異對建系的影響，使得在哺乳動物中目前只成功建立起小鼠、大鼠、食蟹猴和人的單倍體胚胎干細胞系，其他物種尚未有成功的報道。總之，在人類發展和疾病研究的背景下，單倍體胚胎干細胞的研究還將是未來幾年干細胞研究中的重要熱點。