Rab35與腫瘤關系的研究現狀及展望

李美月，田文艷，王穎梅，薛鳳霞

Rab蛋白家族是Ras超家族（包括Ras、Rho/Rac、Rab、Arf 以及Ran 五大類）中最大的亞族，是一類小分子GTP 酶，分子質量大約為20～30 ku，表達于酵母、果蠅、小鼠和人類等各種真核生物中膜相關的細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體、內涵體等）。目前為止，研究已發現人體中Rab 蛋白包含70多個成員，并且在囊泡運輸、蛋白質運輸、膜定位和融合中起調節作用［1］。除了在發育和生理學中的作用，Rab蛋白也已被證明與癌癥的發生和發展密切相關［2］。Rab35 是Rab 鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶家族的成員，是在質膜和內涵體上有獨特定位的Rab GTP 酶，在內吞胞吐循環和胞質分裂中發揮重要作用［3］。另外，Rab35與多種腫瘤遷移和侵襲等生物學特性有關，本文就此作一綜述。

1 Rab35概述

1.1 Rab35的來源和命名 Rab35于1994年首次從人胎兒骨骼肌cDNA 文庫中被發現和克隆得到［4］。在 Rabs 中，Rab35 與酵母 Ypt1p、哺乳動物的 Rab1a和 Rab1b 同源性最高，盡管 Rab35 與 Rab1a、Rab1b具有較高的同源性，但它們在C-末端最后30個氨基酸明顯不同，因而Rab35 被命名為Rab1c 或H-Ray（或Ray）。隨后研究者對編碼真核細胞膜運輸機制的基因進行比較基因組分析后，將其標注為Rab35。

1.2 Rab35的活化及失活 Rab35可與GTP 或鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）結合，形成活化及失活兩種形式，主要由鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）來調節。GEFs催化Rab35與GTP結合，將Rab35 GDP轉化為Rab35 GTP，即活性形式；GAPs促進 GTP 酶活性升高，GTP 酶將 Rab35 GTP 轉換成Rab35 GDP，即失活形式，因此，Rab35 GTP/GDP 循環由GEFs和GAPs來控制［5］。

已有研究證實，Rab35 特異性GEFs 有Connecdenn1、 Connecdenn2、 Connecdenn3 及Folliculin 蛋白（FLCN）4種。Connecdenn1～3又稱為DENND1A～C，該類分子的DENN（differentially expressed in neoplastic versus normal cells）結構域可作為 Rab35的GEF發揮作用［6］。Rab35 與 DENN 結構域結合，可降低Rab35與GDP的親和力，促進GDP與Rab35解離，從而使GTP得以結合Rab35［7］。FLCN 是一種潛在的Rab35 GEF，該基因位于17p11.2 號染色體上。FLCN基因突變會引起Birt-Hogg-Dubé 綜合征（BHD），該綜合征以皮膚良性腫瘤和腎癌發生率升高為特征。FLCN 的主要序列不存在可辨別的DENN結構域，但FLCN的C末端部分的結構存在DENN結構域［8］。研究發現，Rab35特異的GAPs 有TBC1D10A、TBC1D10B、TBC1D10C，均含有特異的TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）結構域。TBC結構域是一個含有180～200 個氨基酸殘基的保守片段，具有Rab GAP 活性，通過催化GTP 水解來降低Rabs活性［9］。

1.3 Rab35的效應物 Rab35與GTP 結合后形成活性形式，其下游有一系列的效應物，參與細胞分裂、細胞骨架形成等，已發現的Rab35的效應物有OCRL（the Oculo-Cerebro-Renal syndrome of Lowe）、肌成束蛋白、RUSC2（RUN and SH3 domain containing 2）、MICAL（Molecule interacting with casL）、ACAP2（Arf-GAP with coiled-coil,ANK repeat and PH domain-containing protein 2）等。

2 Rab35的功能及其與腫瘤發生有關的機制

Rab35參與許多細胞功能，包括胞質分裂、細胞極性、細胞遷移、膜運輸、吞噬作用、外來體釋放、膜脂質穩態、神經突生長和免疫突觸形成等。

2.1 Rab35 在胞質分裂和細胞兩極分裂中的功能 細胞有絲分裂末期是指從子染色體到達兩極開始，至形成兩個子細胞為止的時期，涉及兩個關鍵步驟即細胞胞質分裂及細胞兩極分裂。Fremont 等［10］研究發現，Rab35 為參與細胞有絲分裂末期的關鍵蛋白，在果蠅細胞中Rab35 是一種能導致胞質分裂缺陷表型（雙核細胞）的蛋白，OCRL作為Rab35的效應物在細胞分裂中具有明顯的作用，敲低Rab35 或OCRL后可導致磷脂酰肌醇4,5-二磷酸［PI（4,5）P2］和F-actin在細胞間橋中異常積累，進一步證實了活化的Rab35 結合OCRL，可將OCRL 募集到細胞間橋，OCRL 水解 PI（4，5）P2 并刺激 F-actin 從細胞間橋清除，最終使細胞分離。此外，有研究也證實，小鼠乳腺上皮細胞有絲分裂過程中F-actin 在細胞間橋中異常積累可導致四倍體細胞形成，從而促進乳腺癌的發生［11］。

同樣作為Rab35 新興的效應物，MICAL 家族為細胞分裂過程中肌動蛋白細胞骨架動態變化和膜運輸的關鍵調節因子［12］。人類 MICAL 家族有3個MICAL蛋白（MICAL1、MICAL2、MICAL3）和 2 個MICAL-L 蛋白（MICAL-L1、MICAL-L2），其含有對肌動蛋白解聚必需的N-末端黃素蛋白單加氧酶（MO）結構域、肌動蛋白結合蛋白結合的鈣調蛋白同源性（CH）結構域、LIM 結構域（Lin- 11，Isl-1 和Mec-3）和Rab 結合結構域（RBD）。盡管MICAL1 和MICAL3具有共同的結構域，但在細胞分裂過程中發揮不同的功能，MICAL1 通過對F-actin 的解聚影響細胞分裂，而MICAL3作為囊泡靶向的中間體，與細胞間橋的穩定性有關。MICAL-L蛋白中不存在MO結構域，細胞分裂的機制不涉及任何氧化還原作用。MICAL-L1 的缺失可導致紡錘體長度異常，染色體分裂滯后，細胞雙核化，進而影響細胞分裂。

在基質膠中培養的犬腎細胞（MDCK）可形成具有中心頂端腔的單細胞層球體（囊腫），每個囊腫由單個初始非極性細胞連續分裂產生。研究顯示，Rab35與MDCK 囊腫發育中的細胞基底極性的建立有關，Rab35從物理動力學上參與胞質分裂與頂端-基底極性的啟動［13］。果蠅體內無縫管的形成也證實了Rab35 參與細胞兩極分裂；無縫管的生長沿著近端軸線極化，并且由Rab35 及GAP Whacked（EPI64A-C的同源物）調節，GTP結合Rab35調控頂端膜囊泡運輸到終端細胞分支的遠端，從而誘導無縫管生長［14］。

2.2 Rab35 在細胞遷移中的功能 研究已經證實，Rab35 和Arf6 可調節內吞作用、黏附分子的分選和再循環，控制肌動蛋白重塑、細胞遷移和胞質分裂。另有研究顯示，Rab35 和Arf6 通常以極性相反的方式調節細胞活性［15］。在細胞黏附的調控中存在Rab35 和Arf6 的相反作用。在上皮細胞中，Arf6 活化后通過促進E-鈣黏蛋白的內吞作用和靶向E-鈣黏蛋白到溶酶體的降解來破壞細胞與細胞間的黏附連接；而Rab35激活可維持細胞表面上的E-鈣黏蛋白，從而促進細胞之間的黏附。Rab35 和Arf6 在細胞遷移中也具有相反的功能。Arf6是整合素主動回收所必需，可導致整合素在細胞表面表達升高和信號傳導增強，隨后刺激細胞遷移；Rab35可抑制整合素回收，敲低Rab35會促進整合素回收到表面，增強細胞遷移。因此，Arf6可限制細胞黏附，促進細胞遷移，而Rab35 促進細胞黏附，限制細胞遷移。Rab35水平失調能特異性地擾亂整合素和其他細胞黏附分子在細胞表面的表達，這與腫瘤的發生、發展可能有一定的關系。

最近研究顯示，Rab35 在肺癌細胞定向遷移過程中起著十分重要的作用［16］。G蛋白偶聯受體激酶相互作用的ArfGAP2（G protein-coupled receptor kinase interacting ArfGAP 2，GIT2）參與不同的細胞過程，如細胞骨架動態變化、膜運輸和黏著斑交換。RUSC2為一種多結構域蛋白，為GIT2的公認結合伴侶。研究證實，GIT2依賴RUSC2對高爾基體的調節控制細胞極化和方向；EGF 誘導Rab35 激活是細胞定向遷移期間RUSC2-GIT2 復合物形成所必需的，即 EGF 刺激 Rab35 活化，活化的 Rab35 與 RUSC2 結合，并促進RUSC2 和GIT2 的結合。鑒于Rab35 對GIT2-RUSC2 復合物的調節，該研究又進一步探索發現，Rab35 的沉默也降低了GIT2 的穩定性和磷酸化并抑制了細胞遷移。因此，Rab35/RUSC2/GIT2通路是肺癌細胞中EGFR 誘導的定向遷移的中心，該通路有望成為肺癌轉移的新的治療靶標［16］。

乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤發病率的首位，乳腺癌細胞常轉移到腦、肺等遠端器官，乳腺癌的預后與其轉移程度密切有關。Zhu 等［17］研究發現，Rab35 是乳腺癌MCF-7 細胞中細胞遷移所必需的，該細胞中Rab35 活性能被Wnt5a 和Dvl2 顯著激活，并且在敲低Wnt5a 和Dvl2 表達時Rab35 活性亦下調；此外，通過Rab35 shRNA阻斷Rab35活性顯著地抑制了Wnt5a誘導的Rac1活性，且可抑制MCF-7細胞遷移。因此，Rab35 作用于 Wnt5a 和 Dvl2 的下游和Rac1 的上游以促進細胞遷移，即通過Wnt5a/Dv12/Rab35/Rac1信號通路促進腫瘤細胞遷移［17］，這為臨床治療中選擇更準確的乳腺癌治療靶點提供了重要的線索。Deng等［18］研究也發現，Rab35/MICAL1的活化可促進ROS 產生，進而導致PI3K/Akt 信號活化，促進乳腺癌細胞侵襲，認為Rab35 和MICAL1 之間有調節乳腺癌細胞侵襲的新型關系，但關于Rab35 如何精確調節乳腺癌細胞中的MICAL1 仍有待研究。

2.3 Rab35 受miRNA 調控的相關機制 子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發病率居女性惡性腫瘤第4位。研究顯示，與正常子宮頸組織相比，子宮頸鱗狀細胞癌組織中miR-720 表達顯著上調，表明miR-720 與子宮頸癌發生有關［19］。Tang 等［20］發現，miR-720通過負性調控Rab35來促進子宮頸癌HeLa細胞的遷移；該研究評估了上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的改變，結果顯示抑制miR-720 和過表達Rab35 對E-鈣黏蛋白和波形蛋白水平具有相反的作用：E-鈣黏蛋白增加，波形蛋白減少。因此，miR-720 可促進HeLa 細胞遷移的內在機制本質上是通過下調Rab35和EMT激活，但是miR-720/Rab35 軸在動物模型和臨床組織中的功能尚未完全明確，仍需要進一步研究。

2.4 Rab35受性激素調控的相關機制 卵巢癌是一種激素依賴性惡性腫瘤。流行病學研究證實，高雄激素水平與上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancers，EOC）的發展相關［21］。Sheach等［22］研究也發現，雄激素可促進雄激素受體（AR）陽性的卵巢癌細胞OVCAR3（卵巢上皮細胞癌）增殖，且顯著上調該細胞GTP 酶的表達，從而促進卵巢癌細胞增殖及遷移；另外，Rab35（雄激素應答中上調最明顯）與AR表達呈顯著正相關。因此，Rab35和AR表達相關的發現支持了Rab35是雄激素應答基因的觀點，Rab35蛋白有望成為反映卵巢癌中AR 功能的生物學標志物。預測哪些患者可能對抗雄激素治療有反應，但Rab35 在卵巢癌中的具體功能仍需要進一步的研究。

3 展望

綜上所述，隨著對Rab35研究的不斷深入，發現該蛋白質作為調節因子所參與的細胞生理功能越來越多樣化，從質膜受體再循環，到胞質分裂、蛋白質分泌、吞噬作用、信號轉導，乃至腫瘤的發生，Rab35均發揮了不容忽視的關鍵作用。除此之外，其在機體組織器官發育和分化，以及疾病發生方面還有一些尚未明確的潛在的重要功能。因此，Rab35是現有研究腫瘤的一個重要基因，其參與腫瘤細胞的遷移、侵襲特性是引起腫瘤表達變化的重要原因之一。而目前對Rab35 的研究有限，雖然已經初步獲得成果，但其確切的生物學特性及影響腫瘤發生、發展的機制仍將會成為今后研究的熱點。探索Rab35的生物學特性和影響機制，將會對探索控制腫瘤的新靶點提供基礎支持，從而指導臨床診斷、治療及預后評估。