Wnt/β-catenin信號通路調控Sp5機制的研究進展

劉濤，宋慶高

特異性蛋白-5（Specificity protein-5，Sp5）的C-末端為81 個氨基酸組成的3 個Cys2His2 鋅指結構，與許多基因啟動子中富含GC/GT的區域結合以介導轉錄的發生［1］。在轉錄因子特異性蛋白（Specificity protein，Sp）家族中，其成員Sp1～Sp9 主要以鋅離子結合的形式發揮作用，體現在基因調控、細胞分化和胚胎發育等方面。Sp5作為Sp家族成員之一，含有5個T 細胞因子/淋巴增強因子復合物（T cell factor/lymph enhancement factor complex，TCF/LEF）結合位點，以介導 Wnt/β-catenin 信號通路對 Sp5 的直接調控［2］。通常，在正常成熟細胞中，Wnt 信號通路處于關閉狀態。而當Wnt 信號通路被激活時，胞質中的β-catenin將以核易位的形式進入細胞核與TCF/LEF結合，結合后啟動Wnt信號途徑，進而激活靶基因的轉錄。Wnt/β-catenin 信號通路在調節細胞增殖、胚胎發育和干細胞自我更新等多種過程中起著至關重要的作用［3］。Sp5 作為經典 Wnt/β-catenin 信號通路的下游位點，不僅在細胞增殖、分化等方面有著重要的調控作用，還可能成為腫瘤治療過程中潛在的生物學靶點［4］。現就Wnt/β-catenin-Sp5通路在組織胚胎發育、腭裂形成、腫瘤發生和不孕癥中的調控作用進行綜述，以期為疾病的防治及進一步的研究提供一定的思路。

1 Wnt/β-catenin通路調控Sp5在胚胎發育中的作用

1.1 在胚胎干細胞中的作用 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESCs）是從早期胚胎或原始性腺中分離出的細胞，在體外培養時具有無限增殖和多向分化的特性。研究發現，Sp5 維持小鼠ESCs 自我更新的機制與白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和轉錄激活子3（STAT3）的調控有關［5］。Sp5 作為 LIF 和 STAT3 的下游靶基因，與其下游Nanog 啟動子結合，從而促進小鼠ESCs 的自我更新。Sp5促進ESCs自我更新的作用在很大程度上依賴于鋅指結構域，完整的鋅指結構域是Sp5 介導Nanog表達和維持小鼠胚胎干細胞多能性必不可少的結構［6］。關于Sp5 的上游信號通路，Ye 等［7-8］發現 LIF-STAT3 和 Wnt/β-catenin 信號通路都可以在Sp5上聚合，激活LIF-STAT3-Sp5或Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路可促進小鼠胚胎干細胞的自我更新。可見，Wnt/β-catenin-Sp5-Nanog信號通路對ESCs的增殖可能有一定的促進作用。因此，了解ESCs自我更新的機制有助于研發培養ESCs的新條件，從而衍生出真正的ESCs。

此外，Sp5 的表達在文昌魚胚胎發育過程中也有所體現，Dailey 等［9］研究發現，Sp5 在從受精卵至神經胚的發育過程中對Wnt/β-catenin 信號有動態反應，胚胎早期β-catenin信號的激活可引起原腸胚后期Sp5 的普遍表達。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）作為Wnt 信號通路中的負調控因子，與腸腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）和軸蛋白（Axin）等構成蛋白降解復合物，促進了β-catenin磷酸化而降解，使Wnt 信號通路處于沉默狀態。 1 -Azakenpaullone（Azk）是GSK3β 的抑制劑，當Azk 發揮功能時，其通過影響蛋白降解復合物的形成而進一步抑制胞質中β-catenin 的磷酸化，使β-catenin進入胞核內積聚，從而激活了Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin 通路激活后，理論上表達量應增加的Sp5 卻在原腸胚后期發生了下降，原因可能是Wnt/β-catenin-Sp5信號通路中存在負反饋環，也可能是胚胎發育過程中Sp5 發生了異位表達，從而使原腸胚后期Sp5表達量下降。

1.2 在多能干細胞中的作用 多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC）具有分化出多種細胞組織的潛能，在器官再生、修復和疾病治療方面極具應用價值。研究發現，Sp5對人PSC的正確分化至關重要。Huggins 等［10］通過染色質免疫沉淀和測序等方法，檢測出 Sp5 是 Wnt/β-catenin 信號通路調控人PSC發育過程中的重要靶點，而且Sp5對人PSC中的Wnt轉錄程序具有負性調控作用，原因可能是Sp5通過抑制由Wnt/β-catenin 信號通路激活的其他基因的表達而發揮作用，如Sp1。此外，Weidinger等［11］在對斑馬魚的研究中發現，Sp5是Wnt8/β-catenin信號通路在中胚層和神經外胚層形成過程中的直接靶點，而且Sp5 對神經中胚層干細胞的自我更新和分化也有著重要的調節作用［12］。因此，了解 Wnt/βcatenin-Sp5在胚胎發育過程中的調控作用有助于為細胞形態發生的機制提供一定的理論依據。

2 Wnt/β-catenin通路調控Sp5在組織發育中的作用

2.2 在腦組織發育中的作用 Sp5在小鼠腦的發育中也有所表達，主要體現在胚胎7.25（Embryonic Day 7.25，ED7.25）至ED10.5這個時期［17］。ED8.0時，Sp5在中腦和間腦中以微弱的原位雜交信號為特點出現表達；ED8.5 時，Sp5 表達水平在中腦和間腦背外側區域變得非常強，在間腦中，Sp5表達同時出現在前頂蓋和上皮組織的區域；ED9.5時，中腦背側區仍有Sp5表達，但在ED10.0—ED10.5之間逐漸消失；ED10.0 時，Sp5 開始在中腦被蓋區表達；與中腦不同，間腦前頂蓋的外側和腹側區域也表達Sp5，至少在 ED10.5 之前表達。關于 Sp5 與 Wnt/β-catenin 信號通路，Fujimura等［13］研究發現，小鼠端腦中激活經典 Wnt/β-catenin 信號通路可促使 Sp5 表達上調，表明Wnt/β-catenin-Sp5 通路也可能在腦的發育過程中有著重要的作用，然而其具體機制尚不清楚。

3 Wnt/β-catenin通路調控Sp5在疾病發生中的作用

3.1 在腭裂形成中的作用 小鼠腭突在ED11.5 時開始發育，至ED17.0 前完成，這個階段中任何環節的錯誤均可能導致腭裂的發生［18］。近年來，本課題組在研究鋅與小鼠腭突發育關系時發現，缺鋅喂養者子代小鼠雙側腭板垂直向生長且不能正常融合，從而導致腭裂發生［19］；通過差異基因的篩選發現，在ED14.5 時，缺鋅組中Sp5-mRNA 表達量比常鋅組（30 mg/kg）高約2.23 倍，比富鋅組（100 mg/kg）高約6.78倍（圖1），其中常鋅組和富鋅組子代小鼠雙側腭板融合較好［20］。可見Sp5與腭發育可能存在一定的關聯，推測Sp5 在腭的發育中起負性調節作用［21］。關于腭突發育的信號通路，有研究發現，Wnt/βcatenin 通路相關基因發生異常可導致腭裂的發生。為研究腭裂相關 Wnt 基因，Menezes 等［22］和 Vijayan等［23］通過采集臨床病例對照（腭裂病人和正常者），對其相關的11 個Wnt 基因和33 個單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）進行檢測，結果發現 Wnt3 rs142167、GSK3B rs1331459、APC rs448475 等基因多態性與唇腭裂顯著相關，表明Wnt/β-catenin 通路可直接調控腭的發育過程。然而，母體缺鋅時是否通過Wnt/β-catenin信號通路的異常激活引起Sp5 發生高表達，從而導致腭裂的形成，其機制尚不清楚。

Fig.1 Comparison of Sp5-mRNA expression between zinc deficiency group,normal zinc group and zinc-rich group at ED14.5圖1 ED14.5時缺鋅組與常鋅組及富鋅組Sp5-mRNA表達對比

3.2 在腫瘤形成中的作用

3.2.1 在消化系統腫瘤中的作用 結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。Takahashi 等［24］先采用半定量RT-PCR的方法對結直腸癌組織和其相應的非癌性黏膜中的Sp5 進行檢測，結果發現6例癌組織中均檢測到Sp5高表達；隨后，通過免疫組織化學染色技術檢測結直腸癌腫瘤細胞和基質細胞中Sp5 的表達，結果顯示10 個結直腸癌組織中9 個癌細胞的細胞核有高水平的顯色，而在基質細胞和非癌性上皮細胞中染色較弱。Herbst 等［25］也發現 Sp5 在幾個結直腸癌細胞系中的表達普遍上調。然而，Miyamoto等［26］發現，在結直腸癌細胞株HCT116 中，Sp5 的表達未被上調，原因可能是Sp5 具有上調細胞周期抑制因子P27，從而抑制HCT116細胞增殖的潛力。盡管如此，大多數學者仍認為在這種病理狀態（如癌癥）下，Sp5表達通常會被上調［27］。Takahashi等［24］利用cDNA 微陣列技術證實了Sp5 是與Wnt/β-catenin信號通路相關的基因。為進一步檢測β-catenin 是否在結直腸癌中積累，Mologni等［28］利用病毒shRNA介導沉默了β-catenin、免疫球蛋白轉錄因子2（ITF2）和鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS），發現結腸腫瘤細胞的增殖率分別減少了88%、72%和45%；聯合阻斷β-catenin 和ITF2 或 KRAS，對腫瘤細胞的增殖產生了更明顯的抑制作用，說明Wnt/β-catenin信號表達與腫瘤細胞的增殖呈正相關。 關于FLYWCH1，它是一種新型的核β-catenin 抑制劑。Muhammad等［29］發現，過表達的FLYWCH1通過結合胞核內未被磷酸化的β-catenin，有效抑制了Wnt/βcatenin 傳導的轉錄活性，選擇性阻斷了與結直腸癌細胞形態和遷移有關的下游基因表達，增加了鈣黏素介導的細胞附著，抑制了結直腸癌細胞的轉移。除結直腸癌外，Wnt信號異常激活也可能導致胃癌、食道癌和肝細胞癌的發生［30-32］。Evason等［33］通過轉基因技術和微陣列分析也發現，轉基因組通過特異性激活β-catenin促進了斑馬魚肝癌的發生。

3.2.2 在乳腺癌中的作用 為了更好地了解乳腺癌發生的機制，Chen 等［34］將 Sp5 轉入未檢測到內源性Sp5 表達的乳腺癌細胞系MCF-7 中，結果促進其顯著生長，表明Sp5 對乳腺癌細胞的生長具有明顯的促進作用。Hoverter 等［35］研究發現，Sp5通過抑制細胞周期抑制因子p21的表達，促進了人乳腺癌MCF-7 細胞的生長。關于信號通路，Khramtsov 等［36］研究發現，Wnt 信號通路的激活是基底樣乳腺癌的主要特征之一，也是乳腺癌較低生存率的表征。Lamb等［37］也發現，與正常細胞相比，乳腺癌干細胞中的Wnt 信號通路被異常激活，進一步抑制Wnt 信號通路，結果顯示乳腺癌干細胞的活性降低。因此，調控Wnt/β-catenin-Sp5 通路在乳腺癌靶向治療中有著一定的潛力。

3.3 在不孕癥中的作用 人的生殖發育主要體現于優質胚胎是否能在良好的子宮內膜上順利著床，在這個過程中，藥物干預可以促進胚胎細胞與子宮內膜細胞的黏附。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類單體，具有改善哺乳動物生殖的功能。張玉梅等［38］研究發現，黃芩苷通過活化 Wnt/βcatenin-Sp5信號通路，使Sp5表達水平顯著升高，高表達的Sp5 通過解除Sp1 對人子宮內膜細胞巖藻糖基轉移酶Ⅳ（FUT4）的抑制作用，提高了人子宮內膜細胞FUT4的蛋白表達水平，從而促進子宮內膜細胞與胚胎細胞的黏附。這一研究理論促進了輔助生殖技術的發展，并為不孕癥的診斷和治療提供了理論基礎和新的思路。

4 總結與展望

綜上所述，Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路僅是復雜調控網絡中的一個分支，在干細胞的維護、細胞增殖、凋亡及腫瘤的形成過程中發揮了重要的作用。然而，Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路在調節機體的發育過程中可能具有雙面性：一方面在細胞誘導和細胞黏附中表現出積極的促進作用，另一方面卻在腭突發育及腫瘤細胞形成中發揮了負性調控作用。目前，關于Sp5的報道仍然較少，其具體分子機制仍需要大量實驗去研究。總之，Sp5 可能是多種疾病預防和診斷的生物學標志物，對Wnt/β-catenin-Sp5通路的及時調控可能為防治腫瘤的轉移、腭裂及其他先天性疾病的發生提供新的思路和治療方法。