誘導化療后進展期聲門上喉癌切緣及分子標志物研究

張文超，張強，岳玖玲，卓姍姍，潘毅，張侖

喉癌以鱗癌為主，5年生存率為50%～70%，聲門上癌占喉癌的45%～50%［1］，對于局部進展期（T3～4，N0～2，M0）聲門上癌，臨床常采用誘導化療來控制腫瘤局部生長，達完全緩解（CR）、一些部分緩解（PR）病例可行同步放化療，化療效果不佳者行手術治療。經過誘導化療會形成“腫瘤退縮區”，給術中判斷腫瘤的范圍及邊緣帶來困難。有研究認為某些標志物與喉癌安全邊界相關，其中真核翻譯起始因子4E（eIF4E）是翻譯啟動因子復合體關鍵部分，在很多腫瘤組織中100%表達，而在正常喉黏膜中呈陰性表達［2］；生存素（survivin）是迄今發現的最強的凋亡抑制因子，在喉癌中也呈高表達，而在息肉及正常組織中無表達［3］；細胞周期蛋白D1（cyclinD1）過表達可使細胞不停地進入細胞周期，由高到低在喉癌、乳頭狀瘤中表達［4］；P27在細胞周期中起負性調節作用，在喉癌、乳頭狀瘤、正常黏膜中表達逐漸升高［5］。目前對于化療后的手術切緣界定以及通過組織芯片（TMA）技術同時檢測喉癌相關的4種標志物與切緣的關系國內外鮮有報道。本文通過TMA 技術檢測上述標志物在腫瘤退縮后不同距離的癌旁最短切緣組織中的表達，結合與局部復發率的相關性，確定安全切緣的生物學指標，探尋一種更為準確的喉癌化療后手術切緣判定方法。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2011年5月—2014年11月天津醫科大學腫瘤醫院頭頸科收治的95例（總體組）進展期聲門上喉癌（T3～4，N0～2，M0）患者的臨床病理資料，其均行誘導化療，臨床、隨訪資料完整。其中CR 12例，PR 54例，病情穩定（SD）24例，疾病進展（PD）5例，化療有效率（CR+PR）為69.5%（66/95）。排除12例CR病例和19例PR病例進一步行放化療而未行手術者，以及5例PD病例理論上無“腫瘤退縮區”者。最終納入59例經過2 個周期誘導化療+手術治療、標本保存完好且標本蠟塊有充足瘤緣的喉癌患者為研究對象，男54例，女5例；年齡43～72歲，中位年齡61歲。按國際抗癌聯盟UICC（2002）TNM分期標準：均為聲門上型，Ⅲ期49例（T3N0M0 11例，T3N1M0 38例），Ⅳ期10例（T4N1M0 8例，T3N2M0 2例）。術式：水平半喉切除 54例，3/4 喉切除4例，次全喉切除1例。術后病理檢查均確診為鱗狀細胞癌，切緣未見癌細胞；組織學分級高分化32例，中分化24例，低分化3例。以往的臨床經驗認為未化療的喉癌外科切緣應達到5 mm 以上相對安全［6］，因此本研究按距腫瘤最短切緣（Margin）每5 mm 分為一檔：＜5 mm（Margin 1）14例、5～10 mm（Margin 2）17例及＞10 mm（Margin 3）28例，共3組。

1.1.2 臨床治療 所有患者術前均接受誘導化療，未接受放療，采用TPF 方案，多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶（5-FU）2周期，間隔21 d。具體方案：第1天靜脈滴注多西他賽60 mg/m2+順鉑 80 mg/m2，第 2～5 天靜脈泵注 5-FU 750 mg/m2。化療結束后4周，依實體瘤療效評價標準（RECIST1.1）［7］評估治療效果，根據化療前后喉鏡及強化CT 結果統計CR、PR 率。并行手術治療。

1.2 組織芯片的制備組織芯片制備系統及空心蠟模、石蠟塊制備及蠟芯取材與點樣由西安艾迪生物科技有限公司完成。每組選取2 張石蠟塊，范圍45 mm×25 mm，組織陣列儀（MTA-1，美國Beecher）打出間距合適、直徑1.5 mm，深度為3～4 mm的孔，排列成8×9陣列。先將所有病例的供體蠟塊水平切片，根據切片蘇木精-伊紅（HE）染色鏡檢結果進行標記，觀察記錄癌灶距切緣的最短距離，在蠟塊上沿最短切緣方向定向取材，選定有代表性的癌巢、距原發癌最短距離邊緣（最短切緣）共2個標記，用組織陣列儀細針獲取同直徑組織塊，擠壓到已打好的石蠟塊孔里，制成排列有59例原發瘤（T）、最短切緣（Margin）組織芯片蠟塊，2 張組織芯片共容納59×2=118個陣列。術中已對切除腫瘤時保留的黏膜切緣行常規病理檢測無癌細胞殘留，取喉正常黏膜組織作對照。按同樣方法組建另一組病例和陣列相同的2張組織芯片蠟塊于4 ℃密封保存，以備重復實驗。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 主要材料 鼠抗人p27單克隆抗體（ZM0340）、兔抗人cyclinD1單克隆抗體（ZA0101）購自北京中杉金橋公司，鼠抗人eIF4E 單克隆抗體（sc9976）及兔抗人survivin 多克隆抗體（sc10811）均購自Santa Cruz Biochemology，Inc。

1.3.2 實驗方法組織芯片用SP 法行eIF4E 及P27 免疫組化染色［8］，ABC 法行survivin、cyclinD1 免疫組化染色［9］，實驗步驟：室溫脫蠟，水化組織切片，蒸餾水、PBS 各3 次，予以抗原熱修復；分別加入上述4種一抗工作液過夜孵育，PBS漂洗后加入生物素標記的二抗工作液（ABC法PBS漂洗后加ABC試劑，孵育），PBS漂洗后DAB染色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照，已知的陽性切片作為陽性對照。每個檢測指標均在另一張組織芯片上重復1次。

1.3.3 結果評定 免疫組化染色結果由2名副主任醫師以上病理醫師采用盲法對該組病例獨立進行評判。eIF4E蛋白定位于細胞質，以腫瘤胞質出現明顯深棕黃色顆粒為陽性著色；CyclinD1、P27 蛋白均定位于細胞核，無背景著色情況下以細胞核中出現明顯棕黃色顆粒者為陽性著色；survivin 在胞質、胞核均可有陽性著色。評判標準：eIF4E、survivin 的表達：隨機讀取10個高倍（×400）視野，按照5%的界值確定2種標志物在外科切緣基底細胞層細胞的表達水平，如果＞5%的上皮細胞觀察到著色即判斷為陽性［10］；cyclin D1、P27 的表達：如果＞30%的上皮細胞核著色即判斷為陽性［11］。

1.4 安全切緣的評價 光鏡下觀察每個病例腫瘤退縮區和最短切緣區的細胞形態及上述標志物表達情況，比較不同最短切緣與喉癌術后3年局部復發率的關系，評價手術安全切緣。

1.5 隨訪 隨訪期自2011年5月—2018年5月，患者術后每半年定期復診隨訪，所有患者術后隨訪期均達到36個月以上或至患者死亡，中位隨訪期42個月，無失訪。隨訪時行纖維喉鏡及CT檢查并記錄喉內情況及有無原位局部復發。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0 進行統計學分析，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗及Fisher 精確概率法分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片陣列及染色結果 排列有59例原發瘤（T）、最短切緣（M）組織芯片蠟塊，每行陣列以T開始，每對T、M組織相鄰排列，依次類推。2張組織芯片共容納59×2=118個陣列，見圖1；每個陣列組織取材完整，免疫組化染色可靠，見圖2；高倍鏡下見免疫組化陽性染色組織定位準確，見圖3。

Fig.1 Tissue microarray圖1組織芯片陣列

Fig.2 Immunohistochemical staining of margins in tissue microarray under low magnification microscopy（P27,×40）圖2 低倍鏡下單個組織芯片陣列圖（P27染色，×40）

2.2 腫瘤退縮區光鏡下表現 療效為PR、SD 病例均可形成鏡下腫瘤退縮區，SD病例肉眼下退縮區可能不明顯，僅鏡下可見。與術前相比，術中肉眼可見化療后腫瘤可呈同心圓似的整體向心性退縮，有3例梨狀窩內側壁腫瘤可完全消失而呈纖維化、硬化狀態（圖4A）；腫瘤退縮區鏡下改變：組織結構不清，細胞形態消失，腫瘤細胞變性、壞死，被纖維組織分隔成多個細胞島（圖4B）。有的呈大片狀壞死，僅可見殘余瘤細胞島。腫瘤退縮壞死區免疫組化染色多為陰性（圖4C）。

2.3 腫瘤退縮后不同距離最短切緣的光鏡下結果比較 原發瘤化療后可見壞死及腫瘤退縮；不同切緣組術中常規病理檢查切緣均陰性。Margin 1組切緣中10例含有腫瘤退縮區（10/14），可見壞死變性的瘤細胞；Margin 2組切緣中不含腫瘤退縮區，有2例不典型增生（2/17）；Margin 3組切緣不含腫瘤退縮區（0/28），呈增生及正常黏膜上皮，見圖5。

2.4 不同切緣組eIF4E、survivin、cyclinD1、P27 的表達差異組織芯片免疫組化染色顯示，eIF4E、survivin 在原發瘤T 高表達，3 個切緣組的陽性表達率隨切緣增大急劇下降，除T組與Margin 1組差異無統計學意義外，其余組間多重比較差異均有統計學意義。各組cyclinD1、P27的陽性表達率差異均無統計學意義，見表1。

Tab.1 The positive expressions of eIF4E,survivin,cyclinD1 and P27 in different margin groups表1 不同切緣組eIF4E、survivin、cyclinD1、P27的陽性表達例（%）

2.5 不同切緣組局部復發率比較 59例喉癌患者中術后3年復發12例（20.3%），其中Margin 1組11例（78.6%），Margin 2組1例（5.9%），Margin 3組0例，3組3年復發率差異有統計學意義（χ2=38.643，P＜0.05），Margin 1組明顯高于 Margin 2 和 Margin 3組（P＜0.05），Margin 2 與Margin 3組間差異無統計學意義。

3 討論

外科手術是目前局部進展期喉鱗癌主要的治療方式，且治療重心由提高生存率轉移到兼顧喉功能的保留，國內醫院部分喉切除率較高［12］。對于局部T3以上進展期聲門上病變，臨床常采用TPF 方案術前誘導化療來控制腫瘤局部生長，降低臨床分期［13］。規范化療后療效達到CR、PR 的病例可選擇同步放化療繼續治療，療效SD的患者建議手術，部分PR患者仍有強烈的手術愿望［14］。本研究嚴格按照規范要求選擇經過2 周期誘導化療后療效SD 的24例及療效PR中一部分不接受放化療的患者實施手術。

接受術前誘導化療后的病例中，術中可見呈浸潤性生長的腫瘤發生向心性消退，腫瘤體積縮小，區域中組織結構不清，細胞形態消失，經鏡下證實部分腫瘤周邊轉化為“正常”組織，成為“腫瘤退縮區”［15］。即使療效評價為SD的病例，光鏡下也可以出現腫瘤壞死之后形成的退縮區，只是退縮程度小于CR、PR［16］，這給術中判斷腫瘤的范圍及邊緣帶來困難。當誘導化療后少量變性的癌細胞或微癌灶只存在于腫瘤退縮區或切緣區域時，常規病理學檢查不可能對切緣組織的全部切片逐片觀察，極易造成漏檢。在病理學診斷為切緣陰性的患者中，仍有10%～30%的病例出現了局部復發［17］，因此誘導化療后形成腫瘤退縮區，使手術切緣更加難以判斷，也會對術中冰凍判斷切緣是否無瘤造成影響，留下局部復發的隱患。

在未經化療直接手術者，經驗主張切緣最少達到5 mm，而目前文獻中切緣的名稱也不一致，有外科切緣、陰性切緣、干凈切緣、分子切緣等［6］，具體切除范圍缺乏基本的實驗依據和理論支持，僅停留在憑術者經驗判斷切緣是否安全的水平，不可避免對治療效果造成影響。本研究中聲門上喉切除后最短切緣是基于對術后標本的測量，因為距離腫瘤最短的切緣是喉內局部復發的重要影響因素，而聲門上癌切除范圍相對較大，切緣組織豐富，研究組可以取到標本理想的最短切緣。

腫瘤在細胞形態發生明顯變化之前，可出現癌基因表達增強，也可能出現抑癌基因的下降［18-19］，誘導化療后不同標志物的表達也可能出現改變，但誘導化療后手術的喉癌切緣的標志物研究尚少見相關報道。本研究選取的eIF4E、survivin、cyclinD1、P27是研究較多的幾種與喉癌手術切緣、侵襲性及預后相關的標志物，可能在不同切緣表達梯度呈現遞增或遞減的趨勢，與喉癌分子邊界確定有關。與常規的免疫組化方法相比，本研究利用組織芯片技術可以多指標、高通量地對誘導化療后腫瘤退縮不同距離的最短切緣基因異常表達進行檢測。結果顯示，胞核著色為主的cyclinD1 與P27 在各切緣長度組呈現相反的變化趨勢；前者表達水平隨切緣距離的增加而降低，后者表達隨切緣距離的增加而升高，但尚未形成有統計學意義的表達趨勢，不適合作為切緣標志物；eIF4E、survivin原發灶高表達，Margin 1組表達降低，但部分切緣可見腫瘤退縮區，易引起局部復發，3年局部復發主要集中在Margin 1組，占78.6%；Margin 2組表達極低，未見明顯退縮區，3年局部復發率僅占5.9%；在Margin 3組無陽性表達，也未見腫瘤退縮區及3年局部復發，提示eIF4E、survivin 是比較敏感的分子切緣指標；進展期聲門上癌化療后10 mm以上的距離是相對安全的切緣，化療后腫瘤有所退縮，應該適當擴大手術切緣范圍，達到基本切除腫瘤退縮區，加之標志物表達陰性，使切緣更安全。

總之，聲門上喉癌術后局部復發是治療失敗和影響患者預后的重要原因，喉功能保留手術切緣的掌握非常重要。誘導化療后腫瘤退縮，有利于實施部分喉切除術，通過組織芯片技術高通量地對化療后喉癌手術切緣處基因趨向表達進行檢測和分析，eIF4E、survivin 可能作為評價誘導化療后聲門上喉癌切緣安全性比較敏感的標志物，其陰性表達的10 mm以上的外科切緣有利于腫瘤退縮后的切緣安全。

Fig.3 Immunohistochemical positive staining of four markers in laryngeal squamous cell carcinoma under high magnification microscopy（×400）圖3 高倍鏡下4種標志物在喉癌原發灶（T）中的免疫組化陽性染色（×400）

Fig.4 Tumor retraction mode microscopy and IHC staining after chemotherapy（×100）圖4 化療后腫瘤退縮模式鏡下表現及免疫組化染色（×100）

Fig.5 The shortest margins of tumor retraction area after chemotherapy圖5 化療后腫瘤退縮區最短切緣