程序性壞死在肝移植圍術期誘導腸損傷中的研究進展

王永旺，王清平，喻文立，杜洪印

肝移植期間由于阻斷下腔靜脈（IVC）和門靜脈（PV），引起腸黏膜充血性缺血，導致腸道運動下降和腸黏膜屏障功能破壞［1］。腸黏膜屏障中復雜的微生態系統失衡，導致腸源性細菌和內毒素過度產生，增加細菌轉移或內毒素進入靜脈或淋巴系統，導致腸外遠隔器官損傷［2］。因此，肝移植圍術期保護腸黏膜上皮細胞屏障，是圍術期管理的關鍵環節，也是預防多器官功能衰竭（MODF）和全身炎癥反應綜合征（SIRS）的有效策略。程序性壞死是一種新發現的壞死調控通路，其功能是調節細胞發育及組織平衡，在腸組織缺血再灌注損傷（IRI）中具有重要作用［3］。程序性壞死不同于凋亡，可以引起SIRS，并表現為大量炎癥細胞浸潤［4］。程序性壞死發生發展包括線粒體裂解、溶酶體和胞膜裂解，具有細胞壞死的特點，但卻與通常理解的壞死不同，其中最重要的不同是其核質沒有發生明顯變化，而且可以被受體交互蛋白1（receptor-interacting protein kinases-1，RIPK1）特異性阻斷劑necrostatin-1 逆轉［3］。本研究將從肝移植圍術期腸損傷發生的病理生理基礎、腸道并發癥發生原因、程序性壞死機制等幾個方面進行綜述。

1 腸-肝軸的意義

肝臟與腸道在胚胎發育階段擁有共同的起源——前腸。腸道淋巴細胞起源于發育中的肝臟，表明2個器官之間在解剖結構和生物學功能上存在諸多內在聯系。腸道與外界環境相通，微生物群寄居于此，含有比人類多數倍的基因原材料，可以產生無數的代謝物質，如激素/肽類、抗原/細菌相關模式分子（P/MAMPs）、細菌產物/毒素。肝臟不僅暴露在腸源性P/MAMPs，而且吸收腸道產生的細菌代謝物、微生物與乙醇、乙醛、三甲胺和短鏈游離脂肪酸等食物作用代謝物，是大多數肝病的發病原；如酒精性或非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）［5］、脂肪性肝炎（NASH）［5］、肝細胞性肝癌［6］、進行性肝纖維化/肝硬化和肝硬化并發癥［7］。肝硬化形成后，自身病變導致腸黏膜屏障功能紊亂和腸源性細菌移位，從而引起并發癥，如肝性腦病、自發性細菌感染和腹膜炎、肝腎綜合征以及血流動力學紊亂［8］。甚至，肝硬化患者的膽汁酸池和信號通路也發生較大改變。總之，肝硬化時腸黏膜損傷是多因素共同作用的結果。肝硬化時腸道內膽汁缺乏，腸黏膜失去了膽汁的營養和保護作用；腸道內細菌移位和內毒素增多，直接破壞腸黏膜屏障，并引起炎性反應及氧化應激、細胞凋亡和壞死增加、細胞增殖受到抑制等，使腸黏膜損傷進一步加重。

2 肝移植術胃腸并發癥及機制

肝硬化患者常常發生胃腸道（gastrointestinal，GI）癥狀。研究報道，大約80%肝硬化患者，伴隨1到多個胃腸相關癥狀的發生［9］。肝移植圍術期常見胃腸癥狀包括腹脹（49.5%）、腹痛（24%）、腹瀉（13.3%）以及便秘（8%）［9］。胃腸癥狀嚴重程度與肝臟疾病嚴重程度、乳果糖使用、腹水癥狀和心理應激［9］以及血清睪酮水平直接相關。而門靜脈高壓腸道微血管病變癥狀，可能出現在所有胃腸道［10］。研究證實，肝硬化患者腸道運輸功能不全，其中35%的患者具有不同程度的小腸動力延遲和蠕動緩慢，這可能與腹瀉和腹痛增加有關［11］。小腸細菌過度增殖也與肝硬化直接相關［12］。因此，肝硬化引起小腸運輸延遲，導致小腸細菌增殖，進而引起腹痛和腹瀉。文獻報道，小腸細菌增殖可導致細菌移位和感染性并發癥，例如自發性細菌腹膜炎［12］。

肝硬化患者腸黏膜通透性增加，伴隨發生細菌移位進入腸系膜淋巴結，導致腹水產生，引起自發性腹膜炎［13］。而且，肝硬化患者腸道細菌產物、內毒素和細菌DNA可能引起免疫系統激活，導致循環狀態紊亂，引起腎衰竭和肝性腦病［7］。肝硬化并發癥發生是由于肝臟清除內毒素能力下降，炎性細胞因子的生成過多；如內毒素誘發巨噬細胞釋放一氧化氮和促炎因子；促炎因子和一氧化氮釋放反過來進一步引起腸黏膜屏障功能紊亂［8］，導致免疫和血流動力學紊亂，心功能不全［14］。文獻報道，酒精性肝病患者誘導發生脂肪性肝炎前，酒精先誘導腸道滲漏和內毒素血癥［5］。此研究提出“滲漏”的腸道可能在慢性肝病發病機制中起重要作用。

肝硬化腸黏膜屏障功能不全的病理生理機制非常復雜。乙醇和其代謝物乙醛及脂肪酸乙酯主要通過一氧化氮調控氧化應激和活性氧（ROS）產生，細胞支架改變可能導致緊密連接紊亂；同時也可以導致腸上皮細胞（IEC）直接損傷［15］。門靜脈高壓本身可能導致細胞間隙擴張的腸壁水腫，影響腸黏膜屏障完整性，導致腸黏膜通透性增加［12］。而且，腸道特別是小腸細菌增殖引起微生物生態系統紊亂，影響腸黏膜屏障功能，增加腸黏膜通透性；研究發現，帕內特細胞抗菌宿主防御功能不良，引起肝硬化大鼠細菌移位［16］。腸黏膜屏障功能不良，不僅發生在肝移植圍術期或急性排斥反應損傷后，而且還可以見于術前營養不良。肝移植術后腸黏膜屏障損害程度不同見于腸道運動減弱、結構破壞和分泌減少，導致腸機械屏障損傷。甚至，腸道微生態失衡和消化液分泌減少損傷化學和生物屏障。腸道相關淋巴組織萎縮和腸道分泌IgA 減少，引起免疫屏障失效［17］。因此，腸黏膜屏障的保護對肝移植受體顯得尤為重要。

3 程序性壞死與肝移植術腸損傷

3.1 程序性壞死的分子機制 當發現腫瘤壞死因子（TNF）可以激活不同途徑的細胞死亡，凋亡調節和壞死的被動調節的觀念已經受到挑戰［18］。細胞死亡與典型凋亡的形態變化一致，表現為凋亡小體形成、細胞體積收縮、染色質凝集、細胞膜致密變化和空泡樣變性。但是，在程序性壞死刺激時，TNF可以引起細胞壞死，包括細胞器腫脹、大量的空泡形成和核固縮［18］。既往認為壞死的發生存在著被動性和未調控性，但以上研究提示壞死在腸黏膜上皮細胞受腫瘤壞死因子受體（TNFR）調控。當半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性被阻斷后凋亡受到抑制，出現死亡受體誘導的細胞壞死；然而關于死亡受體誘導的細胞壞死的生理特點尚不明確［19］。2003年，Chan 等［20］研究表明 RIP1 在獨立于凋亡途徑的 TNF誘導細胞壞死通路中具有重要意義，也第一次把“壞死”和“程序性”組合起來，成為程序性壞死。程序性壞死隨后演變為壞死性凋亡。

敲除caspase-8 或Fas 相關死亡域蛋白（FADD）基因后，然后再分別敲除RIP1 或RIP3 基因大鼠，形成caspase-8/RIP3 或FADD/RIP1 基因缺失雙突變鼠［21］。該研究結果顯示，胚胎表型 caspase-8 或FADD缺失鼠直接受RIP1和RIP3調節，進一步發現這些大鼠的細胞并未發生死亡受體誘導的細胞死亡。提示在胚胎發展時期FADD 和caspase-8 的功能是為了調控RIP調節的細胞死亡。

研究證實，程序性壞死和凋亡一樣，也可受到細胞內信號通路的調控；而且細胞凋亡和程序性壞死的調節信號分子具有高度的重疊性［22-23］。在生理條件下，TNFR 可以形成TNFR 復合體Ⅰ，其可以調節細胞存活和參與形成分子信號TNF受體相關死亡結構域蛋白（TRADD）、TNFR相關因子2/5（TRAF2/5）、細胞凋亡抑制蛋白1/2（cIAP1/2）和RIP1［24］。復合體形成后激活典型的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，增加細胞存活［25］。相反，在細胞激活狀態下，環境影響TNF-α 結合誘導形成選擇性TNFR 復合體：TNFR 復合體Ⅱ，即著名的死亡誘導信號復合體（DISC）。TNFR 復合體Ⅱ促進凋亡，組成包括 FADD、TRADD 和 caspase-8［26］。有研究表明，TNFR 復合體Ⅱ可引起凋亡，并招募RIP1、RIP3來誘導和調節程序性壞死［26］。程序性壞死通路：RIP1 首先在去泛素化酶（Cyld）作用下完成去泛素化［26］，然后 RIP1 結合到 TNFR 復合體Ⅱ，通過結合RIP同型交互模體RIP3［27］。在穩定條件下，caspase-8 通過蛋白酶裂解，控制RIP1 和RIP3 激活，抑制程序性壞死［19］。另外，去泛素化酶Cyld是caspase-8的底物。TNF-α 激活后，caspase-8 清除 Cyld，抑制RIP1 去泛素化，導致泛素化的RIP1 結合存活復合體［28］。但是，當通過藥理手段敲除 caspase-8 基因后，復合體Ⅱ不會抑制RIP1 和RIP3 的激活，那么就可以限定的機制來誘導RIP3自身磷酸化，從而引起細胞程序性壞死。RIP1 和RIP3 的蛋白表達已經被認為是壞死性凋亡的必要過程，RIP3決定了細胞走向程序性壞死的敏感性［29］。

3.2 程序性壞死在肝移植術腸損傷中的作用 腸上皮細胞增殖和凋亡受到體內信號嚴格調控，從而保證腸黏膜完整性及腸屏障功能有效性。腸組織的絨毛頂端和隱窩區域是IEC 發生死亡的常見部位。腸黏膜發生缺血缺氧損傷后，細胞死亡可以清除損傷、老化的細胞，增殖形成新的細胞層。程序性壞死可以快速破壞腸細胞膜，導致細胞內損傷相關分子模式（DAMPs）等物質釋放，例如HMGB1 蛋白、熱休克蛋白、DNA和RNA，進而引起炎性反應［30］。IEC死亡數量過多，就會引起腸屏障破壞，細菌進入腸壁，發生炎性反應。

研究發現，IEC 特異性RIPK1 基因敲除鼠發生致命的腸道病理變化，其原因可能與FADD-caspase-8 誘導細胞凋亡，或者TNF 引起的炎癥有關［30］。在無菌環境下，培養 IEC 特異性 RIPK1 敲除鼠或RIPK1/RIPK3 敲除鼠，不能抑制其凋亡和壞死的病理過程，提示RIPK1 缺乏上皮細胞的發生壞死必要因素并不包括微生物。在NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路激活時，不需要RIPK1激酶活性；但是其可以通過凋亡或程序性壞死來調控細胞死亡。一方面，RIPK1 激酶活性缺乏只會部分抑制，但不會防止RIPK3介導的FADD敲除IEC和角化細胞發生程序性壞死；證實體內存在RIPK1 激酶活性依賴和不依賴2 條通路來調控程序性壞死。另一方面，RIPK1 激酶活性缺失合并敲除RIPK3 可以保護鼠免受TNF誘導的SIRS［31］。

研究證實，IEC 敲除FADD 后，程序性壞死自身可以激動促炎性反應；從而增加IEC死亡數量，最終產生自發性結腸炎和回腸炎［31］。鼠RIPK3基因敲除后結腸和IEC 壞死和炎癥反應受到抑制；研究結論是RIPK3 調控IEC 程序性壞死引起的腸炎癥反應［30］。無菌環境下抑制MyD88或TNF信號通路后，IEC敲除FADD基因鼠結腸炎發生明顯受到抑制，但不會抑制潘氏細胞壞死和回腸炎發生；結果表明RIPK3調控IEC 壞死和炎癥通路在結腸和小腸是不同的。IEC 特異性敲除caspase-8 基因后，通過RIPK3信號通路而不是TNFR1引起潘氏細胞壞死和回腸炎［30］。有趣的是，與IEC 敲除 FADD 基因鼠比，基因caspase-8 敲除后不會發生結腸炎，提示FADD和caspase-8在調控結腸IEC方面具有不同的功能。

4 小結與展望

程序性壞死是調控細胞死亡的重要通路，與凋亡不同的是，其不依賴caspase 蛋白酶的死亡方式，而是通過RIP1 和RIP3 的蛋白激酶相互作用及磷酸化程序性壞死。這種死亡模式又具有凋亡的優勢，即可調控，可以通過阻斷劑Nec-1 調節RIP 激酶的活性控制程序性壞死的發生發展。目前研究證據說明程序性壞死可以參與肝移植圍術期的移植物和遠隔器官損傷，甚至移植物無功能和排斥反應導致移植物壞死。但是仍有很多問題函待解決，例如如何調控壞死小體激活和形成，RIPK1 和RIPK3 激酶活性是如何調控的，程序性壞死對于炎癥的啟動、進展以及慢性發展是如何發揮作用的等。