農藥原藥全組分分析雜質結構剖析

曹立冬，吳進龍，張宏軍，李鳳敏，黃啟良*

(1.生物性危害因子控制重點實驗室/中國農業(yè)科學院 植物保護研究所，北京 100193；2.農業(yè)農村部農藥檢定所，北京 100125)

農藥原藥全組分分析是指針對有效成分、含量達到0.1%及以上的任何雜質以及FAO、WHO或者是各國農藥主管部門規(guī)定的任何含量水平的相關雜質(即對人類和環(huán)境具有明顯的毒害，或者對使用作物產(chǎn)生藥害，或引起農產(chǎn)品污染，或影響農藥產(chǎn)品質量穩(wěn)定性，或引起其他不良影響的雜質)的定性和定量分析，鑒定出的組分總的質量含量一般須在98%～102%之間[1]。農藥登記資料一般需提供至少5個批次具有代表性的工業(yè)化生產(chǎn)原藥的全組分分析報告，所以原藥全組分分析又稱5批次全分析。農藥全分析資料是進行國內外農藥登記及市場開發(fā)不可或缺的重要技術資料。對新農藥而言，全分析報告是進一步對其安全性進行評價的重要化學依據(jù)；對于申請相同產(chǎn)品登記而言，全分析報告是認定其是否與已登記原藥“等同”的重要依據(jù)。

原藥全組分分析最有技術含量且最有挑戰(zhàn)性的工作是含量>0.1%的雜質的定性鑒定。原藥中的雜質可以比作是原藥的“指紋”，是判斷原藥合成工藝的重要參數(shù)，也是相同產(chǎn)品認定的關鍵要素。作者根據(jù)近年來從事原藥全分析的經(jīng)驗，結合實例分析，談談原藥中雜質結構剖析的一些思路和方法。

1 原藥中雜質來源

原藥中的雜質主要來自于反應原料(原料、原料中雜質和溶劑)、中間體和副反應產(chǎn)物。副反應主要包括降解、異構化、水(溶劑)解、氧化反應、過度取代、重排等反應。在眾多來源中，原藥合成所用的原料及合成中間體是最容易判斷且標準品易得的，原藥生產(chǎn)企業(yè)基本上都有每步反應的中間體保留且存檔。原料中的雜質比較難以推斷的，需要對原料進行定性分析從而判斷其在原藥中的結構。原藥中最常見的雜質來自于副反應，包括以上提到的各種類型的反應。因此，快速準確的進行原藥中雜質的結構推斷，需要具有豐富的有機化學反應理論和實踐經(jīng)驗。

2 原藥中雜質結構剖析的一般思路

對于原藥全分析，首先要進行預實驗分析確定含量≥0.1%的雜質個數(shù)，一般借助于液相色譜或者氣相色譜分析，通過峰面積百分比進行雜質個數(shù)的確定。對于液相色譜，有效成分和雜質的色譜響應與所選擇的檢測波長緊密相關，如果僅僅選擇最適合有效成分的波長，則有些雜質可能會因該波長下響應弱，出現(xiàn)峰面積百分比<0.1%或者沒有色譜響應。因此，為了準確進行雜質個數(shù)的判斷，建議選擇3D掃描模式進行原藥預分析。圖1為噻苯隆原藥3D掃描模式下的色譜圖，可以清晰的看出每個雜質組份在每個波長下的色譜響應情況。

圖1 噻苯隆原藥色譜圖(3D掃描模式)

色譜確定好雜質個數(shù)后，進行質譜分析，根據(jù)質譜數(shù)據(jù)結合合成工藝，推斷雜質可能的結構。質譜分析也可以進行雜質數(shù)量的確定，有的雜質色譜響應很弱，卻具有很強的質譜響應，這點也需要在全分析過程中引起足夠的重視。對于結構比較確定的雜質，如果合成步驟簡單就通過合成獲取雜質標準品，或者直接進行購買商品化標準品。對于含量較高，且與有效成分及其它雜質分離度較高雜質，根據(jù)質譜信息難以推斷出合理的化學結構，通過液相制備色譜進行富集，然后結構鑒定。對于含量很低的雜質，可以先通過重結晶原藥，提高雜質含量，母液進行液相色譜制備。雜質標準品獲得后，通過與原藥中雜質色譜保留時間(液相還需要比對紫外吸收光譜圖)和質譜數(shù)據(jù)的比對，進行雜質結構的定性確定。

3 原藥中雜質結構剖析實例分析

3.1 利用核磁裂分和偶合常數(shù)進行異構體結構鑒定 對于同分異構體，僅僅通過質譜數(shù)據(jù)難以準確進行結構判斷，利用核磁裂分和偶合常數(shù)可進行異構體的結構鑒定。氰氟草酯原藥通過質譜解析，發(fā)現(xiàn)存在一個同分異構體雜質，推斷可能的結構，進行定向合成。由于親核取代反應的選擇性，得到2個同分異構體1和2(圖2)?；衔?和2由于極性接近，難以通過常規(guī)的柱層析分離，我們借助于液相制備色譜進行分離，然后分別進行核磁共振氫譜(1H NMR)測定。借助于核磁裂分和偶合常數(shù)進行異構體結構鑒定(圖3)，通過色譜保留時間比對分析，確定氰氟草酯原藥中存在的同分異構體雜質為化合物2。

圖2 氰氟草酯同分異構體雜質合成路線

圖3 氰氟草酯同分異構體雜質21H NMR譜圖

在氟磺胺草醚原藥全分析中，通過質譜解析，發(fā)現(xiàn)存在一個雙硝基化的雜質，由于硝基可能存在芳環(huán)不同的位置，給結構鑒定帶來了困難。我們根據(jù)合成工藝及可能的反應位點，推斷可能的雙硝基化雜質，進行定向合成，得到2個雙硝基化雜質3和4(圖

4)，然后分別進行核磁共振氫譜(1H NMR)測定。借助于核磁裂分和偶合常數(shù)進行異構體結構鑒定(圖5)，通過色譜保留時間比對分析，確定氟磺胺草醚原藥中存在的雙硝基化雜質為化合物3。

圖4 氟磺胺草醚原藥雙硝基化雜質合成路線

圖5 氟磺胺草醚原藥雙硝基化雜質1H NMR譜圖

3.2 水解副反應雜質鑒定 原藥有效成分合成工藝中經(jīng)常會用到水溶液，并且原藥儲存過程中也很容易接觸到空氣中的水分子，從而發(fā)生水解反應。水解產(chǎn)物是常見的一種副反應雜質，該類雜質也非常容易制備，原藥在適當?shù)臈l件進行水解反應可大量制備水解產(chǎn)物。以氰氟蟲腙和螺蟲乙酯為例，水解產(chǎn)物5和6可以方便的通過一步反應制備(圖6)，反應后經(jīng)過簡單的過濾和重結晶即可得到高純度水解產(chǎn)物。

圖6 氰氟蟲腙和螺蟲乙酯水解產(chǎn)物5和6合成路線圖

3.3 有機溶劑參與副反應雜質鑒定 原藥在合成工藝過程會經(jīng)常用到有機溶劑，原藥全分析也會用到有機溶劑溶解。如果有機溶劑參與反應，就會發(fā)生溶劑解反應，從而帶來新的雜質。在做異菌脲全分析過程中，配制異菌脲溶液最初選擇的是甲醇，發(fā)現(xiàn)有新的色譜峰出現(xiàn)，且隨著時間的延長，該色譜峰峰面積逐漸增加，通過液質分析，發(fā)現(xiàn)該化合物為異菌脲的同分異構體7(圖7)，甲醇作為親核試劑進攻異菌脲導致開環(huán)異構化(圖8)[2]。

圖7 異菌脲甲醇異構化反應

圖8 異菌脲甲醇異構化反應可能的機理

吡唑醚菌酯原藥中經(jīng)常出現(xiàn)質荷比為435的雜質，結合原藥合成工藝，我們推斷是原藥合成最后一步的中間體與反應溶劑1，2-二氯乙烷進行親核取代反應帶來的雜質8(圖9)。

圖9 吡唑醚菌酯原藥中質荷比為435雜質生成途徑

3.4 多(少)鹵(氟、氯、溴)代副反應雜質鑒定 鹵素(氟、氯、溴)廣泛存在于農藥分子中，在鹵代反應過程中經(jīng)常出現(xiàn)多(少)鹵代雜質出現(xiàn)，鹵素原子的個數(shù)可以通過質譜數(shù)據(jù)中[M+4]：[M+2]：[M]的豐度比判斷。在苯嗪草酮原藥全分析中，通過質譜解析，發(fā)現(xiàn)多一個氯原子的雜質，結合合成工藝，我們推斷可能的雜質為苯環(huán)上氯原子對位取代，并設計了該雜質(化合物9)的合成路線(圖10)。非常幸運的是，我們合成的雜質正好是原藥中存在的雜質，該雜質的結構也經(jīng)過了1H NMR確證(圖11)。

圖10 苯嗪草酮原藥中氯代雜質合成路線

圖11 苯嗪草酮原藥中氯代雜質1H NMR譜圖

吡唑醚菌酯原藥中經(jīng)常出現(xiàn)質荷比為465的雜質，根據(jù)同位素相對豐度，推斷該雜質為吡唑醚菌酯多一個溴原子。結合原藥合成工藝，我們推斷可能是吡唑醚菌酯的吡唑環(huán)與溴發(fā)生了溴代反應，生成溴代雜質10(圖12)，為進一步驗證該雜質的結構，我們一步合成了該溴代雜質，并與原藥中的雜質進行了比對確認。

圖12 吡唑醚菌酯原藥中溴代雜質合成路線

3.5 不完全(過度)氧化(還原)反應雜質鑒定 氧化還原反應是農藥合成工藝中非常常見的反應，不完全(過度)氧化(還原)會帶來副產(chǎn)物。吡唑醚菌酯原藥中出現(xiàn)質荷比為610的雜質，按照正常的雜質推斷思路，非常難以解析。仔細分析原藥合成工藝，發(fā)現(xiàn)中間體存在一步硝基還原反應，理想的中間體產(chǎn)物應該為羥胺，如果硝基還原不完全則會生成亞硝基，羥胺與亞硝胺進行加成反應并消除一分子水，則生成質荷比為610的雜質11(圖13)。乙蟲腈由硫醚氧化得到，過度氧化會生成雜質12(圖14)。

圖13 吡唑醚菌酯原藥中質荷比為610雜質生成途徑

圖14 乙蟲腈過度氧化雜質生成途徑

3.6 重排反應雜質鑒定 化合物在某些特定的條件下會發(fā)生重排異構化或者重排消除反應，從而導致雜質的生成。魚藤酮環(huán)外雙鍵會發(fā)生重排異構化反應得到熱力學更穩(wěn)定的環(huán)內雙鍵異構體13(圖15)。啶嘧磺隆原藥會發(fā)生重排消除反應得到雜質14，進一步發(fā)生水解反應可得到雜質15(圖16)。

3.7 特殊反應雜質鑒定 有機化學反應類型眾多，有一些不太常見，我們可稱之為特殊反應。比如在稻瘟靈原藥全分析過程中，發(fā)現(xiàn)了一個結構高度對稱的雜質16，結合合成工藝，我們推斷有硫代二烯酮中間體生成，發(fā)生[2+2]環(huán)加成反應即可得到雜質16(圖17)。該雜質的結構進一步經(jīng)過了1H NMR確證(圖18)。

圖15 魚藤酮環(huán)外雙鍵異構化

圖16 啶嘧磺隆重排消除反應途徑

圖18 稻瘟靈原藥中雜質16 1H NMR譜圖

4 結論

原藥中雜質制備主要通過定向合成和液相制備色譜富集；雜質純化主要有柱層析、重結晶、液相制備色譜等三種途徑；雜質結構鑒定主要通過核磁、紅外、質譜和高分辨質譜進行。以上介紹的副反應類型僅僅是筆者在全分析工作過程中經(jīng)常遇到的反應類型，實際上原藥的品種繁多，可能涉及的副反應類型更多，雜質結構剖析也會遇到更大的挑戰(zhàn)。通過上述介紹不難看出，原藥中雜質結構剖析是一項難度很大的工作，不僅需要分析化學的技術，更需要具備豐富的有機化學的反應理論和有機合成的實踐經(jīng)驗。