超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中的30種獸藥殘留

◎ 黃正華

（譜尼測試集團深圳有限公司，廣東 深圳 518000）

我國在水生物養殖、禽類飼養以及畜牧業生產等過程中會使用各種獸藥，其中包括喹諾酮和青霉素等，這些藥物的濫用會對人體產生一定的影響，當人體內的藥物積累到一定程度后，就會出現耐藥性，甚至導致畸形、突變等嚴重后果[1]。目前在獸藥檢測領域中普遍使用的一種方法是超高效液相色譜-串聯質譜法。

1 實驗方法

1.1 設備與試劑

使用的設備包括超高效液相色譜儀Agilent1290，三重四極桿質譜儀6460，高速冷凍離心機、水浴式的氮吹儀、高純凈水儀、超聲波振蕩器等。試劑包括甲酸、正己烷、乙腈、甲醇、氯化鈉、三氯乙酸、C18吸附劑。實驗過程中所使用的水均是通過高純水凈化而來。此外，還包括19種喹諾酮標準品，恩諾沙星、司帕沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、培氟沙星、吡哌酸、奧比沙星、依諾沙星、馬波沙星、達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、司帕沙星、沙拉沙星等，還有11種青霉素標準品，如苯氧乙基青霉素、雙氯青霉素、鄰氯青霉素、甲氧苯青霉素、苯咪青青霉素、苯氧甲基青霉素、芐青霉素、乙氧萘胺青霉素、雙氯青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、苯氧乙基青霉素等。

1.2 標準溶液的配制

先將喹諾酮標準品使用10毫升的甲酸進行溶解后用乙腈作為溶劑。而青霉素類標準品則以50%乙腈水溶液作為溶劑，然后將30種標準品配制成500 μg·mL-1濃度的單標儲備液，并避光冷藏保存。根據所需初始比例流動相進行稀釋，從而獲得濃度適當的標準混合工作溶液，現用現配。

1.3 預處理方法

稱取均質樣品5.0 g，置于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入10%三氯乙酸溶液-乙腈（20∶80）的混合液10 mL，勻漿1 min，室溫超聲提取10 min，于室溫以8 000 r·min-1的速度離心5 min，將清液轉移到50 mL離心管中，剩余的殘留物加入1%甲酸乙腈溶液10 mL進行二次提取，合并清液，加入適量氯化鈉，同時添加C18吸附劑0.5 g，渦旋1 min，室溫以8 000 r·min-1的速度離心3 min。準確提取9 mL清液于15 mL離心管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流動相溶解殘余物，旋渦1 min，低溫離心3 min，取下清液過0.22 μm濾膜，準備上機檢測。

1.4 標準工作曲線的配制

稱取陰性樣品，根據預處理方法進行處理，濃縮盡干，并加1.2中稀釋好的不同濃度標準混合工作溶液1.0 mL，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流動相溶解殘余物，旋渦1 min，低溫離心3 min，取下清液過0.22 μm濾膜，得到標準工作溶液。

1.5 儀器條件及定量

MS條件，30種待測的獸藥質譜參數：電噴霧離子源，MS/MS分辨率設置成unit，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速10.0 L·min-1，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為11.0 L·min-1。定量的方法：用1.4中的不同濃度標準工作溶液上機機檢測，制作標準曲線，用曲線校正1.3得到的樣液，保留兩對特征離子與時間定性，用離子對峰面積進行定量，外標法計算樣品中30種待測的獸藥的濃度。

2 結果與討論

2.1 優化質譜條件

通過電噴霧離子源的正離子掃描模式，系統分析三十種獸藥，待測物質都轉化成轉分子離子峰，屬于一種[M+H]+的形式。通過單離子SIM的掃描方法對所有待測物質的裂解電壓進行單獨優化，找出母離子最佳裂解電壓，隨后通過SCAN掃描方法對碎片離子進行系統分析，找出最佳碰撞電壓，從而得到較好響應的離子對。同時在檢測多殘留的過程中，通過的多反應動態監測手段來分析樣品提高檢測結果的準確性與靈敏度。通過多反應動態監測這一手段，能夠結合被測組分不同的保留時間，進行分段的MRM掃描，從而提高所有檢測物質的掃描時間，提升靈敏度。以下介紹了其中30種藥物的質譜參數，具體見表1。

表1 30種藥物的質譜參數表

2.2 改善色譜條件

通過分離效果以及時間等因素對3種色譜柱進行了對比分析，主要分析了SB-C18柱、SYMNETRYSHIELD RP18柱和ECLIPSEPLUSC18RRHD柱3種色譜柱。其中，RP18柱酸性流動相體中對于青霉素藥物的重現性和峰形并不是十分突出。SB-C18柱的整體分離結果會對DMRM參數的制定產生影響，結合各種因素，最后選擇C18RRHD柱，能都獲得預期結果。

結合相關文獻資料以及以往分析經驗[2-3]，在酸性流動相下能夠促進被測物質的離子化，有效提高靈敏度，此次研究中主要是通過組合乙酸銨溶液、甲酸水溶液、甲醇以及乙腈等溶液，并分析其靈敏度與分離效果，隨后挑選出最為適合的流動相體系，最終結果證明，將乙酸銨與甲酸添加到水相中都能促進靈敏度的有效提升。從系統平衡消耗時間以及便捷性等角度進行分析，在此次實驗中主要是水相加入甲酸，經過不斷試驗后，選擇含量為0.2%甲酸溶液為流動相，能夠得到最佳效果。和甲醇比較起來，乙腈反相洗脫能力更好，同時基線噪音影響也比較小，增加了洗脫程序的靈活性，為此可以將乙腈選定為有機相，提高洗脫穩定性。用0.2% 甲酸水溶液作為水相，0.2%甲酸乙腈溶液作為有機相，通過分析豬肉樣品，空白譜圖我們能夠發現，這一環境下沒有任何干擾物。

2.3 創新預處理方法

和乙酸乙酯、丙酮、甲醇等比較常見的提取劑相比，乙腈在提取高蛋白樣品過程中的沉淀效果比較突出，但是在濃縮最終階段依然會發生渾濁等問題，通過將一定量的三氯乙酸添加的提取液當中，能夠適當減少渾濁問題，結合青霉素這一類型藥物在酸性狀態中穩定的特點，可以將乙腈和三氯乙酸充當提取溶劑，隨后通過1%甲酸乙腈進行二次提取。

2.4 考察基質效應

因為超高效液相色譜-串聯質譜法從原理層面分析，基質不能全部消除，因為經常會利用內標法、標準添加法以及稀釋法等修正基質效應中的誤差。此次研究過程中主要是利用優化洗脫程序有效降低了基質效應。

2.5 檢測實際樣品

根據相關實驗流程從市場流通商品中購買19份豬肝、26份魚肉以及61份豬肉進行檢測，從而對30種獸藥進行快速檢測，結果發現1例恩諾沙星的陽性豬肉樣品，1例環丙沙星的陽性魚肉產品，隨后將陽性的魚肉產品與豬肉產品和國家下發的標準方法進行比較分析。結果顯示，這3種檢測方法的最終結果大致相同，見表2。證明此方法可以應用于殘留獸藥快速檢測工作。

表2 各種方法的樣品檢測結果表

3 結論

本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法對11種青霉素類型以及19種喹諾酮類型在內的30種殘留獸藥進行檢測。其中通過三氯乙酸乙腈溶液來提取樣本，再利用C18吸附劑和氯化鈉對提取液進行吸附和分層后進行濃縮，經過正己烷脫脂后，采用多反應動態監測掃描方式進行測試。和目前我國文獻報道以及國家標準的相比較，超高效液相色譜-串聯質譜法具有較高的靈敏度與準確性，同時簡化了其中比較復雜的預處理過程，更加便于操作，能夠滿足獸藥殘留檢測的實際需求，可為動物源性食物中各種獸藥殘留的定性和定量分析提供參考。