HPLC法檢測面條中的乙二胺四乙酸二鈉

◎ 許 秦，劉依涵

（昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650000）

乙二胺四乙酸二鈉是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的添加劑，有防腐、穩(wěn)定、抗氧化、凝固的作用，可以被用于飲料制品、乳制品、醬腌菜、罐頭及果脯等食品中。若不按規(guī)定或超限量使用乙二胺四乙酸二鈉，就會影響人的身體健康，導(dǎo)致人體中微量元素的流失，對上呼吸道、眼睛、黏膜產(chǎn)生影響，可引起嘔吐、腹瀉、和急腹痛等癥狀，還可引起暫時性的腎臟功能障礙或血壓下降。我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了乙二胺四乙酸二鈉作為食品中添加劑的使用規(guī)則、允許使用的食品種類和允許使用量的范圍及殘留量，但面條中不允許添加乙二胺四乙酸二鈉[1]。

在實際的食品監(jiān)管中發(fā)現(xiàn)，乙二胺四乙酸二鈉能降低面粉中多酚氧化酶的活性，延緩面條酶促褐變的過程，減少對面條感官品質(zhì)和營養(yǎng)成分的影響。因此，一些面條商販為了使面條的外觀好看、勁道和口感好，存在超限量使用乙二胺四乙酸二鈉的情況。

目前，國內(nèi)外有很多快速高效檢測乙二胺四乙酸二鈉的相關(guān)文獻，主要的檢測方法有HPLC法、LC-MS法、氣相色譜法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等[2-7]。我國關(guān)于檢測食品中乙二胺四乙酸二鈉的標(biāo)準(zhǔn)有SN/T 3855-2014和GB 5009.249-2016等，適用于飲料、果脯、醬腌菜和鐵強化醬油等食品的檢測，沒有面條中乙二胺四乙酸二鈉的檢測方法[8]。本文擬建立一種快速高效檢測面條中乙二胺四乙酸二鈉的方法，為實際的食品監(jiān)管工作中乙二胺四乙酸二鈉含量的測定提供一定的技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

賽默飛Ultimate3000高效液相色譜儀（配備DAD檢測器）、AL104電子天平（梅特勒-托利多）、ALLEGRAX-30R離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）、KQ5200DB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品（購于Stanford Chemicals公司）、鹽酸（GR）、甲醇（色譜純）、三氯甲烷（色譜純）、三氯化鐵（AR）、抗壞血酸（AR）、乙酸鈉（AR）、四丁基溴化銨（AR），試驗用水均為去離子水；超市購買2種面條。

1.2 實驗方法

1.2.1 0.02 mol·L-1三氯化鐵溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.540 6 g FeCl3·6H2O，溶解于90 mL水中，加入0.03 mL鹽酸，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.100 40 g至50 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得2.008 mg·mL-1的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取乙二胺四乙酸二鈉儲備液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL和2.0 mL于含有20 mg抗壞血酸的50 mL容量瓶中，加入適量水和1 mL FeCl3溶液，超聲15 min，冷卻至室溫后，用水定容至刻度，即得含乙二胺四乙酸二鈉 2.008、4.016、10.04、20.08、40.16 μg·mL-1和80.32 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品前處理及衍生化

準(zhǔn)確稱取粉碎過的樣品5 g（精確到0.01 g）于50 mL已具有20 mg抗壞血酸的離心管中，加入15 mL水，渦旋 2 min，4 500 r·min-1離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，15 mL水重復(fù)提取1次，合并提取液于50 mL容量瓶中。向提取液中加入1.0 mL FeCl3溶液，超聲20 min，冷卻至室溫后定容至刻度，混勻后過0.45 μm濾膜，濾液備用。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C184.6×150 mm，5 μm；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，流動相為甲醇∶水（含有 0.02 mol·L-1四丁基溴化胺和 0.03 mol·L-1乙酸鈉緩沖溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH=4）=1∶4。進樣量：20 μL，檢測波長為254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長和絡(luò)合劑的選擇

乙二胺四乙酸二鈉能夠與大多數(shù)金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，且優(yōu)先與穩(wěn)定常數(shù)大的金屬離子進行絡(luò)合。乙二胺四乙酸二鈉與三價鐵離子絡(luò)合化合物的穩(wěn)定常數(shù)大于與二價銅離子絡(luò)合化合物的穩(wěn)定常數(shù)，因此選用FeCl3作為絡(luò)合劑。對其絡(luò)合物在190～400 nm進行全波長掃描，最大吸收波長在250 nm附近（見圖1），因此本方法采用254 nm波長檢測。

圖1 乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合物等吸收圖

2.2 流動相的選擇

據(jù)相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，乙二胺四乙酸二鈉檢測流動相有兩種：①SN/T 3855-2014《出口食品中乙二胺四乙酸二鈉的測定》中所用的流動相，為0.075 mol·L-1的磷酸二氫鉀（pH=2.3）-甲醇（90∶10，V/V）。②SN/T 1018-2001《出口食品罐頭中乙二胺四乙酸二鈉的測定》方法中所用的四丁基溴化胺-乙酸鈉混合溶液（pH=4.0）-甲醇（80∶20，V/V）。高效液相色譜法測定腌漬蔬菜罐頭中乙二胺四乙酸二鈉的含量中，對兩種流動相的研究表明四丁基溴化胺-乙酸鈉混合溶液作為流動相時，檢測更佳[9-11]。因此本實驗選擇四丁基溴化胺-乙酸鈉混合溶液作為流動相。在該實驗條件下，乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合物峰型良好（見圖2），滿足實驗要求。

圖2 乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合物色譜圖

2.3 線性范圍

在該確定的實驗條件下，以乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合物的濃度為橫坐標(biāo)，其峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明當(dāng)絡(luò)合物的質(zhì)量濃度2.0～80.0 μg·mL-1時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.000 0（見圖3），回歸方程為y=0.474 8x-0.035 6。

圖3 乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 樣品前處理

SN/T 3855-2014《出口食品中乙二胺四乙酸二鈉的測定》中在提取時均需要加入三氯甲烷，衍生化后也需要加入三氯甲烷進行凈化[12-13]。加入三氯甲烷的原因是為了除去色素、脂肪等雜質(zhì)的干擾，但由于面條中雜質(zhì)較少，結(jié)果顯示面條樣品中加入三氯甲烷進行除雜質(zhì)和凈化和不加三氯甲烷，不會在色譜圖上產(chǎn)生明顯差異（見圖4和圖5）。在樣品中均未檢測到乙二胺四乙酸二鈉。

圖4 樣品前處理不加三氯甲烷圖

圖5 樣品前處理加三氯甲烷圖

2.5 方法的加標(biāo)回收率

前處理方法按加三氯甲烷和不加氯甲烷兩種，以不含乙二胺四乙酸二鈉的面條為樣品，做3個添加水平，每個添加水平平行測定6次，檢測方法的回收率。結(jié)果表明前處理方法加三氯甲烷和不加三氯甲烷的加標(biāo)回收率也無太大差異，見表1、表2。因此，對于面條樣品的處理，可以不加三氯甲烷除雜質(zhì)和凈化。

表1 不加三氯甲烷方法回收率表（n=6）

表2 加三氯甲烷方法回收率表（n=6）

2.6 檢出限與定量限

向空白面條粉末基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)品，以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限（LOD）為3.34 mg·kg-1；以10倍信噪比（S/N=10）確定定量限（LOQ）為11.15 mg·kg-1。

2.7 精密度

稱取5 g面條樣品，加入0.5 mL 2.008 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，平行測定6次，測得RSD為0.065%，表明該方法重復(fù)性良好，準(zhǔn)確可靠，滿足實驗需求。

3 結(jié)論

本文建立了面條中乙二胺四乙酸二鈉的高效液相色譜方法和前處理方法，乙二胺四乙酸二鈉的絡(luò)合物質(zhì)量濃度為2.0～80.0 μg·mL-1，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為1.000 0，加標(biāo)回收率為92.48%～98.02%，RSD為0.065%。該方法操作簡便，準(zhǔn)確度、精密度都比較高，為今后面條中乙二胺四乙酸二鈉的檢測提供了方法和技術(shù)參考。