菌種超低溫保存法與人工傳代法的比較

◎ 梁梅娟，陳亞波，蘇佩冰

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

菌種檢驗是微生物檢驗工作必不可少的環節，且數量、品種繁多，由此菌種的保存非常重要。菌種的長期保存，一直是科研工作中的重要內容。

冷凍干燥法曾被認為是最為理想的保存方法，但已有文獻報道，認為該保存法會使菌種的性質發生改變[1-2]。人工傳代法的操作雖簡單，但費時、費工、效率低，且反復傳代會增加菌種污染的機會。

因而尋求一種簡單易行、較長期有效的菌種保存方法一直是實驗室研究的熱點和所期望的目標。本文對超低溫法（-80 ℃）與人工傳代法保存菌種的效果，結合文獻資料進行了比較觀察，其中超低溫法（-80 ℃）采用兩種方法保存，菌種保存液法及瓷珠菌種保存管法，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 保存菌的菌種名錄

本研究共使用的15種菌種，分別購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心及美國ATCC。自編號、菌種名稱、菌種編號見表1。

表1 菌種一覽表

1.2 菌種保存液的配制

K2HPO412.6 g、檸檬酸鈉0.98 g、MgSO4·7H2O 0.18 g、KH2PO43.6 g，甘油88 g，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后，置于4 ℃備用[3]。

1.3 菌種保存方法

將已經按照菌種說明進行復蘇的菌種接種于相應的肉湯培養基中，（36±1）℃培養所需要的時間。培養結束，將菌液離心后加入新鮮的培養基，再加入等體積的菌種保存液，分裝于菌種凍存管，標注菌種名稱、菌種編號、代數及傳代日期，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中。另外，所有菌種按常規方法作人工傳代法保存，將其保存在半固體培養基或瓊脂斜面上，置于4 ℃冰箱保存，并每隔3個月傳代1次，其中銅綠假單胞菌每隔1個月傳代1次，傳代次數不超過5代，副溶血性弧菌保存于室溫，每周傳代1次。

1.4 瓷珠菌種保存管法

從培養18 h以上的平板上刮去新鮮純培養物于菌種保存管中，配成3～4麥氏比濁度的菌懸液。擰緊保存管，來回顛倒幾次使細菌乳化，不能旋搖。用無菌移液器將菌種保存管內的液體吸取干凈，妥善放置被吸出的液體。擰緊保存管，迅速將其置于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.5 菌種復檢時間與鑒定項目

超低溫保存菌種每隔半年、人工傳代保存的菌種每次傳代進行1次生物學性狀鑒定[4]。

1.5.1 存活力測定

每隔一定時間用營養瓊脂平板傳種各種方法保存的菌種，檢測細菌的存活情況。

1.5.2 典型生化反應檢測

在檢查存活力的同時，進行平板劃線，觀察菌落、菌體形態，革蘭氏染色及顯微鏡下形態，檢測有關典型生化反應特征，比較菌種的生物學特性與原菌種生物性特性的差異。

2 結果與分析

2.1 菌種保存情況的比較

據文獻記載，一般耐受力較強的菌種在-80 ℃可保存15年以上，耐受力較低菌種如乙型溶血型鏈球菌，用低溫保存方法，在-80 ℃可保存10年以上，不耐低溫冷凍的菌種，在-80 ℃也可保存5年以上，大大延長了菌種存活時間[5]。而人工傳代上述菌種，需每隔3個月傳代1次。目前，本實驗室已經對這兩種方法保存菌種進行了2年的試驗，保存菌種的效果見表2。

表2 15種菌種保存效果比較表

2.2 存活力和生物學特性發生改變的情況

采用超低溫保存的菌種，不管是菌種保存液法還是瓷珠菌種保存管法，連續24個月存活均良好，對存活力、菌落形態、革蘭氏染色及顯微鏡下形態、典型生化反應特征等指標，未發現改變，可以繼續保存至更長的時間[6]。采用人工傳代法保存的菌種存活周期為1～15個月，菌種傳代2次鑒定1次，經過幾次傳代，存活力和生物學特性方面都有不同程度的下降和改變。且生物學特性均有不同程度的改變，需要重新購買菌種。

3 討論

結果表明，超低溫保存法比人工傳代法保存時間長，且能保存菌種生物學特性穩定，特別是對于乙型溶血性鏈球菌、產氣莢膜梭菌、副溶血性弧菌，單增李斯特氏菌等需要特殊方法保存的菌種。人工傳代法，既費時、費力，又增加了菌種污染的機會。從本文對-80 ℃保存的15種菌種來看，是完全可達到較長期保存菌種又可臨時使用的目的，不須進行較為繁瑣的反復傳代和減少菌種的污染。

通過對多種菌種的保存實踐，對保存方法進行比較分析和長期觀察，證明超低溫保存方法（-80 ℃）是目前較為理想的菌種保存方法。其優點如下：①保持菌種生物學特性的穩定。經超低溫保存方法保存的細菌、真菌，取出復蘇，菌種長勢良好，經鑒定未發現變異現象。②操作簡單和經濟。超低溫保存方法只需經肉湯培養或鹽水刮下菌液，加入等量保存液，分裝凍存管，注明其保存日期，存放于-80 ℃中。③減少污染機會。超低溫保存方法，菌種在凍存管內封存，需要時取出一支，避免了污染雜菌的機會。但是，對于那些耐受力特別低的菌種，還需要對菌種保護進行摸索、探討，增強其耐受性，以達到與其他菌種相同的存活時間。

綜上所述，超低溫保存方法簡單有效，易于掌握，無需特別的設備，尤其適宜于菌種品種多、菌種量大，使用頻繁的檢測機構作為保存菌種之用。特別是瓷珠菌種保存管的應用，是菌種的保存過程更加簡單快捷，值得推廣應用。