黃萎病脅迫下陸地棉基因組DNA甲基化分析

張效苒，秦一丁，汪保華

(1.南通大學附屬中學，江蘇 南通226019；2.南通大學 生命科學學院，江蘇 南通226019)

1 引言

陸地棉(Gossypium hirsutum L.)作為農業生產上的主要栽培種，具有豐產性好、適應性廣的特點，其產量占世界棉花總產量的90%，占中國棉花總產量的98%。棉花黃萎病(Verticillium dahliae Kleb)是棉花生長過程中會出現的一種危害較嚴重的土傳維管束系統病害，是一種世界性病害，其一般造成棉花產量損失10%～20%，嚴重時可以達到60%以上[1]，并且藥劑難于防治。近年來，棉花黃萎病在我國3大棉區內連續肆虐，并且有逐年加重的趨勢，對棉花的生產造成了極大危害[2]。目前培育的棉花品種多為不抗病或不耐病的，遠遠不能滿足生產需求[3]，因此選育和推廣抗黃萎病的陸地棉品種還是主要的防治措施。

一般來說，植物基因組DNA會在逆境脅迫下發生甲基化水平的改變，而甲基化是DNA表觀遺傳學所研究的重要內容之一。本研究采用甲基化敏感擴增多態性(methylation－sensitive amplified polymorphism，MSAP)技術[4，5]，并引入毛細管電泳檢測黃萎病脅迫下基因組DNA甲基化差異，分析黃萎病脅迫對陸地棉PD94042基因組DNA的影響；并對重要差異片段進行克隆測序，從GenBank中尋找黃萎病抗性相關基因。本研究試圖從分子水平上研究黃萎病的抗性機制，為培育抗黃萎病棉花提供依據；同時希望從中發現黃萎病抗性的相關基因，服務于棉花的抗黃萎病分子育種。

2 材料與方法

2.1 棉花材料及其黃萎病接菌處理

本實驗所用棉花材料為陸地棉(Gossypium hirsutum)材料PD94042，對黃萎病敏感(表1)。將配制好的PDA培養基經120℃、15 min滅菌后，在無菌操作臺上倒入滅菌的平板內。待培養基凝固后，用接種環將黃萎病菌涂布在平板上。放在28℃培養箱中進行培養，定期進行觀察，并按上述方法進行擴盤純化。

取陸地棉種子30粒，然后種植到裝有營養土的紙杯中，在棉花長出4片真葉后，取生長健壯且長勢一致的20株幼苗，均分為4組，每組5株，去除紙杯底部分別放入4個盤子中。其中2個盤子裝有100 m L落葉型棉花黃萎病菌V991懸浮液作為接菌處理，另2個盤子裝有100 m L滅菌水作為對照，每天觀察陸地棉的長勢。夜間溫度控制在18～20℃，白天溫度控制在24～27℃。5 d后，接菌處理組便可明顯看出棉花葉片上出現黃色斑點，且葉片卷曲。取每個植株的第四片葉子放置在－80℃保存備用。接菌后的第3周，根據前人的判斷方法，將感病程度分為0，1，2，3，4，5個等級，定義如下：0表示健康的沒有疾病癥狀，而1，2，3，4分別表示葉片表面的病癥面積小于25.0%，25.1%～50.0%，25.1%～75.0%和大于75.0%的情況[6]。

2.2 DNA提取及MSAP分析

將每組棉花放置在－80℃冰箱中保存的第四片真葉取出，準備提取基因組DNA和RNA。

用CTAB法提取棉花單株葉片DNA[7]。在用最終濃度20μg/m L核糖核酸酶在室溫下消化30 min可完全被消化DNA中的RNA。基于毛細管電泳的DNA甲基化檢測及差異條帶的克隆測序參照錢曉偉等[8]，接頭與引物序列見表2。

表2 用于MSAP分析的接頭和引物序列

同裂酶HpaⅡ和MspI都識別4堿基序列5’－CCGG：HpaⅡ不能酶切含雙鏈5mCCGG、C5mCGG、5mC5mCGG的位點，但能酶切半甲基化序列(單鏈甲基化)；而MspI能酶切單鏈或雙鏈上內部胞嘧啶甲基化C5mCGG，但不能酶切外部胞嘧啶甲基化即含雙鏈或單鏈5mCCGG、5mC5mCGG的位點[9]。多態的比例(MSAP比例)可以使用以下公式計算MASP的多態性比例：

3 結果分析與討論

3.1 陸地棉基因組DNA甲基化水平

本研究利用MSAP法檢測了陸地棉黃萎病脅迫及對照下的DNA甲基化情況。MSAP分析中共選用了4個EcoR I選擇性擴增引物，8個HpaⅡ/MspI選擇性擴增引物，構成32個引物組合，對陸地棉的黃萎病脅迫及對照下經不同組合雙酶切所形成的4個樣本進行擴增。毛細管電泳結果顯示，應用32個引物組合，黃萎病脅迫及對照下均檢測出3440個CCGG位點(表3)，其中，甲基化位點分別為2989個和3038個，分別占總擴增位點數的86.9%和88.3%；平均每引物組合檢測甲基化位點分別為93.4和94.9，黃萎病脅迫下的甲基化總位點數和對照組相比沒有顯著差異。

3.2 陸地棉的黃萎病脅迫和對照組基因組DNA甲基化模式的改變

所有的擴增模式可分為A、B、C和D等4大類15個亞類(表4)。類型A包含4個亞類，表示與對照相比，黃萎病脅迫下的DNA甲基化模式沒有發生改變；且此種DNA甲基化模式變化類型占檢測總條帶的63.1%。類型B包含5個亞類，表明與對照相比，黃萎病脅迫下有16.6%位點DNA甲基化水平降低——次甲基化(hypomethylation)。同樣，類型C也包含5個亞類，該類型的陸地棉黃萎病脅迫下，基因組內相應位點DNA甲基化水平上升(超甲基化)且占18.4%位點。研究中還檢測到一種僅表現為甲基化模式的轉變但不能說明甲基化水平發生改變(類型D)，這種位點占總檢測位點2.1%(表4)。將24個引物組合擴增后帶型類型進行分析比較，發現A、B、C、D帶型存在差異性(圖1)。

表3 MSAP檢測到的陸地棉DNA甲基化模式

3.3 克隆測序及Blast結果

對部分差異片段進行回收及克隆測序。序列經NCBI數據庫進行Blast查詢，比對得到與已知基因相似性較高的4個DNA片段，結果見表5。其中編號為W－124的基因序列與逆轉錄因子有關，編號為W－127的基因序列與陸地棉肌動蛋白解聚因子2(ADF2)mRNA相關，編號為W－135的基因序列與赤霉素20－氧化酶基因(GA20ox3)有關，編號為W－161的基因序列與可可的泛素蛋白連接酶2(TCM_045033)mRNA有關。

表4 對照與黃萎病脅迫下DNA甲基化模式的變化

圖1 黃萎病處理后DNA甲基化不同變化模式比較

DNA甲基化是一種常見的DNA共價修飾方式，普遍存在于高等植物之中。它是將基因型和表型聯系起來的重要紐帶[23]。經檢測，本次研究所使用的棉花品種陸地棉PD94042在黃萎病脅迫下的DNA甲基化情況中的大部分位點(63.1%)的甲基化水平沒有發生顯著差異；而甲基化狀態發生變化的位點中，黃萎病脅迫下發生超甲基化的位點數略高于發生去甲基化的位點數。研究發現在各種甲基化類型中比例最高的是類型Ⅲ，即在黃萎病脅迫下雙鏈外部胞嘧啶發生甲基化或雙鏈內外部都發生甲基化的位點數有所升高。此外，陸地棉PD94042在黃萎病脅迫下總體甲基化位點數略高于對照組，但沒有達到顯著水平。為了更加深入地探究陸地棉抗黃萎病的分子機制，對部分甲基化差異序列進行了克隆和BLAST搜索分析，發現有6個序列與已知基因高度相似，包括逆轉錄轉座子基因、肌動蛋白解聚因子基因、逆轉錄酶基因、赤霉素20－氧化酶基因以及泛素蛋白連接酶基因等。這些基因的表達，可能與棉花對黃萎病的抗性相關。后續將選用更多的抗病性不同的棉花材料，對黃萎病脅迫下的棉花抗病分子機理開展更加深入的研究。

表5 差異序列的BLAST分析結果