小鼠腎小球分離方法比較及原代足細胞鑒定

方 際，吳鶴瑾，王 浩

足細胞在蛋白尿的發生發展中起重要作用[1]，但因其為高度分化的終末期細胞，其體外培養一直較為困難。國外已有實驗室成功建立人、鼠條件永生化足細胞株[2,3]，但細胞株在生長、遺傳特征及細胞結構等方面與原代細胞相差較大，不能很好地模擬相關的腎臟病理生理學狀況，這使基于永生化足細胞株的實驗結果的可信度大大降低。以前的文獻主要集中在大鼠的原代足細胞培養，有關小鼠足細胞原代培養技術少見報道。本研究通過比較差異過篩法和免疫磁珠法，旨在明確小鼠腎臟足細胞原代培養的最佳模式。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57/BL6J小鼠，30 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。激光共聚焦顯微鏡購自Leica SP8公司，相差顯微鏡購自OLYMPUS公司，免疫磁珠購自Dynal公司，PCR 儀購自ABI公司。RPMI 1640培養液購自Cornning公司，Ⅳ型膠原酶、鏈酶蛋白酶E、脫氧核糖核酸酶Ⅰ均購自Sigma公司，胎牛血清購自Gibco公司，Podocin抗體購自Abcam公司，熒光二抗購自Cell Signaling Technology公司，逆轉錄試劑盒及Trizol購自Invitrogen公司，曲拉通 X-100及80、150、300目不銹鋼篩網購自上海生工技術有限公司。

1.2 C57/BL6J小鼠腎小球分離

1.2.1 差異過篩法 小鼠腹腔注射2.5% 戊巴比妥(0.1 ml/30 g)，麻醉后，用75% 乙醇消毒皮膚，先后暴露腹腔、胸腔，行心臟灌注后迅速取出雙側腎臟，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分離腎皮質，用眼科剪將皮質剪成碎泥狀。用注射器針芯輕輕研磨腎皮質，并不斷用D-Hank’s 溶液沖洗。該沖洗液先過80 目不銹鋼篩網，濾過的溶液再過150 目的不銹鋼篩網，最后過300 目篩網。滯留在300 目篩網上即為腎小球初分離物，反復沖洗篩網后，收集分離物制成懸液，靜置10 min 后，1000 r/min離心5 min，棄除上清，收集純化的腎小球沉淀，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成腎小球懸液。

1.2.2 免疫磁珠法 常規動物麻醉、消毒皮膚，采用Liu等[4]方法從胸主動脈灌注，在腎臟建立局部循環。從胸主動脈先用37 ℃預熱的PBS灌注10 ml(5 ml/min)，然后灌注37 ℃預熱的總體積4 ml，包含有(膠原酶10 mg/ml+鏈酶蛋白酶E 10 mg/ml+脫氧核糖核酸Ⅰ 100 U/μl+免疫磁珠 200 μl)液體，灌注結束后迅速取出動物雙側腎臟，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分離腎皮質，用眼科剪將皮質剪成碎泥狀。移入2 ml離心管，再加入上述消化酶1 ml，震蕩孵育37 ℃，300 r/min，5 min。用移液槍輕柔吹打數次，過150目金屬篩1次，借助磁力架洗滌、重懸，轉入離心管中1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成腎小球懸液。

1.3 腎小球形態學觀察和計數 用10%胎牛血清的RPMI 1640培養液懸浮腎小球，倒置相差顯微鏡下觀察其形態。經血球計數板計數不同分離方法得到的每只C57/BL6J小鼠的腎小球數目，同時計算無鮑曼囊腎小球占總腎小球的百分比，即為腎小球純度。以2×104/孔的密度接種于六孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養。

1.4 免疫熒光鑒定 傳代培養7 d，待細胞分化鋪滿瓶底后再行免疫熒光染色。步驟：足細胞以適當密度種植于24孔板上，37 ℃培養至細胞密度為60%～75%。4%多聚甲醛固定15 min，0.5%曲拉通 X-100穿孔15 min，1%牛血清白蛋白封閉30 min，分別加一抗Podocin(1∶1000)4 ℃過夜，然后加1∶500稀釋的二抗室溫反應1 h，然后加DAPI(1∶1000)3 min，上述每步操作后均用PBS漂洗。熒光顯微鏡下觀察。

1.5 PCR法鑒定足細胞的標志蛋白 以永生化小鼠足細胞為陽性對照，小鼠肝細胞系為陰性對照。用Trizol 試劑提取足細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒的操作步驟反轉錄合成cDNA，將產物進行PCR檢測，反應體系參照試劑盒說明書，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環，每樣品做3個復管。

引物和內參序列如下：Podocin-F,5′-CACTCTTCAGTCGCTGTCCA-3′；Podocin-R, 5′-AGTTGATGCTCCCTTGTGCT-3′。GAPDH-F 5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′；GAPDH-R, 5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

2 結 果

2.1 腎小球的分離結果 差異過篩法獲得腎小球純度達(90.2±1.6)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(10 421±2421)個腎小球；視野中腎小球結構完整，可見腎小管碎片。免疫磁珠法獲得的腎小球純度達(96.7±1.2)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(16 112±2651)個腎小球；視野中腎小球結構完整，基本無腎小管。免疫磁珠法獲得腎小球純度和數目均高于差異過篩法，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2 腎小球的培養及足細胞形態學特征 腎小球接種第3天可見80%以上腎小球貼壁，少量腎小球周圍有多邊形細胞爬出(圖1A)，第7～10天所有貼壁腎小球周圍都有大量細胞爬出(圖1B)。消化傳代后的足細胞繼續生長，為多邊形，無突起伸出，細胞迅速生長至融合狀態，呈鋪路石樣外觀(圖1C)。第14天可呈完全分化狀態，細胞體和細胞核較增殖狀態顯著增大，自細胞體伸出明顯的樹枝樣突起，常見雙核，相鄰細胞間形成連接(圖1D)。

圖1 腎小球培養的原代足細胞

A.培養第3天(×200)；B.培養第7天(×200)；C.培養第14天(×100)；D.培養第14天(×400)

2.3 腎小球足細胞鑒定

2.3.1 免疫熒光染色鑒定 原代培養的足細胞均有Podocin蛋白染色，熒光閃亮，呈明顯的亮綠色，在細胞漿內以絲狀或線性沿細胞骨架分布，分布均勻，熒光染色細胞比例均為100%，證實了培養的細胞確為足細胞(圖2)。

圖2 原代足細胞Podocin蛋白免疫熒光染色(×200)

A.原代足細胞核DAPI染色；B.原代足細胞漿Podocin染色；C.原代足細胞merge圖片

2.3.2 PCR法鑒定 原代足細胞和永生化小鼠足細胞均有Podocin基因表達，而陰性對照組未檢測到該基因表達(圖3)。

圖3 PCR法檢測小鼠腎臟足細胞中Podocin表達電泳圖

1.原代培養小鼠足細胞；2.永生化小鼠足細胞系；3.肝細胞系

3 討 論

近年來，慢性腎臟病已經成為全球性的公共衛生問題，而終末期腎臟病的發病率逐年增高[5]。在導致腎臟損害的病因中，足細胞作為腎小球濾過屏障的最后一道閘門，其損傷會導致蛋白尿的發生[6]，進而加重腎臟損害[7]。差異過篩法是最傳統的分離腎小球的方法，Krakower等[8]最先報道了分離腎小球的方法，后來在大鼠[9]和兔[10]上也成功地分離了腎小球，在此基礎上，Burlington等[11]改進了該方法，減少了金屬篩對腎小球的損傷。但總體而言，差異過篩法的缺點是分離得到的腎小球純度較低，往往混有腎小管碎片。

為了提高腎小球的純度和數量，Takemoto等[12]首次采用免疫磁珠法分離小鼠腎小球，該方法缺點是費用昂貴。在此基礎上，Zhao等[13]改進了實驗方法，利用四氯化三鐵代替免疫磁珠行體循環灌注，極大降低了實驗成本，但是獲得的腎小球有限。有別于常規的心臟灌注，Liu等[4]采用胸主動脈灌注，在腎臟建立局部循環，較心臟灌注的方法明顯提高了免疫磁珠的使用效率。

本研究借鑒并比較了不同的腎小球分離技術，總結了做好小鼠原代足細胞的培養的一些經驗：(1)分離腎小球建議使用免疫磁珠法，采用胸主動脈灌注，提高免疫磁珠的使用效率；(2)在消化腎臟皮質的時候，建議使用膠原酶，因為膠原酶比較溫和，好掌握消化時間；(3)盡可能地提高腎小球的貼壁率，包括選擇合適的篩網，動作輕柔，全程低溫操作，在最短的時間內完成腎小球分離，使用膠原鋪板的培養皿來種植腎小球，為減少對貼壁的干擾在前3 d避免換液；(4)利用內皮細胞和系膜細胞從腎小球內爬出時間和生長特性不同[14]，在培養10～12 d開始傳代。本研究結果提示，免疫磁珠法較差異過篩法能更高效地分離出高純度的小鼠腎小球。