腌制蔬菜微生物的研究進展

吳麗娜，謝小本，劉東紅，葉興乾，尹源明，周建偉，5，丁 甜，4

(1 浙江大學生物系統工程與食品科學學院，杭州 310058；2 工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津 300457；3 紹興咸亨食品股份公司，浙江紹興 312000；4 浙江大學馥莉食品研究院，杭州 310058；5 浙江大學寧波理工學院，浙江寧波 315100)

腌制是我國最常用的蔬菜加工方法，腌制蔬菜因其工藝簡單，便于保存，風味獨特而且能增進食欲，深受消費者喜愛。蔬菜腌制是指在蔬菜中加入食鹽或者發酵劑，來改變蔬菜口感風味，提高營養價值的一種加工方法。腌制蔬菜按其加工工藝可分為醬漬菜、糖醋漬菜、糟漬菜、糠漬菜、鹽水漬菜6類[3]。我國的腌制蔬菜種類繁多，比較出名的有涪陵榨菜、四川泡菜、東北酸菜等。

發酵作用是利用微生物分解蔬菜營養物質的產物，以及某些微生物本身的味道來增加蔬菜的風味和口感。發酵作用可分為乳酸發酵、酒精發酵、醋酸發酵和丁酸發酵等。乳酸發酵生成的乳酸，可以給蔬菜帶來獨特的酸味，也可以抑制有害菌的生長，有防腐效果；酒精發酵和醋酸發酵產生的少量乙醇與酯類，可以增加蔬菜的特殊香味，有增進食欲的效果；丁酸發酵生成的丁酸，會加速蔬菜的腐敗，也影響風味。因為乳酸菌是兼性厭氧菌，生長繁殖不需要空氣，而大多數有害菌均是好氣菌，所以蔬菜腌制時要隔絕空氣。本文腌制蔬菜微生物研究現狀以及菌種鑒定方式。

1 蔬菜腌制過程中的主要微生物

1.1 乳酸菌

乳酸菌是一種兼性厭氧菌，在蔬菜腌制中具有重要作用，能提高營養價值、改善食品風味、預防腐敗變質。在蔬菜的起始發酵和主發酵階段，占優勢的乳酸菌主要有植物乳桿菌、短乳桿菌、膜狀明串珠菌、戊糖片球菌等[9]。

楊珺等[10]采用常規微生物培養方法，對四川榨菜后熟階段微生物區進行研究，分離得到的細菌參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《一般細菌常用鑒定方法》做相關的生理生化試驗和形態觀察，分別歸于9個屬，12種菌，經進一步的試驗工作，其中乳酸菌主要為植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌等。李正國等[11]采用基于16SrRNA作為分子標記的變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法，分析榨菜腌制過程中不同時期的細菌群落結構，分離鑒定得到7個屬的細菌類群，乳酸菌中乳桿菌是優勢菌群，另外還測出片球菌。在發酵初期，明串珠菌是優勢菌；發酵中期，明串珠菌受到抑制，乳酸細菌迅速成為優勢菌；發酵后期，乳酸菌也受到抑制。

1.2 酵母菌

酵母是一些單細胞真菌，是一種典型的兼性厭氧微生物，在有氧和無氧條件下都能夠存活；同時也是一種天然發酵劑，常用于制作面包和蔬菜腌制。蔬菜腌制中常見的酵母主要是啤酒酵母、產醭酵母和魯氏酵母等[1]。張騰[14]采用PCR-DGGE方法分析研究不同鹽濃度蔬菜發酵過程中的細菌、真菌，結果表明，食鹽濃度4%的發酵蔬菜中細菌體系包括假單胞菌、沙雷氏菌、泛菌及松鼠葡萄球菌等，而真菌微生物主要有Wickerhamomycesanomalus、假絲酵母、季也蒙酵母；食鹽濃度6%的發酵蔬菜細菌體系中含有檸檬明串珠菌和腸系膜明串珠菌以及腸桿菌、泛菌，真菌微生物主要包括釀酒酵母、季也蒙酵母、漢遜德巴利氏酵母、畢赤酵母等；食鹽濃度8%的發酵蔬菜細菌體系中包括沙雷氏菌、拉恩氏菌以及松鼠葡萄球菌，真菌微生物主要為假絲酵母、畢赤酵母、Wickerhamomycesanomalus及馬克斯克魯維酵母。

1.3 醋酸菌

在腌制過程中，原料蔬菜表面附著的少量醋酸菌能在有氧條件下將酒精氧化為醋酸。在蔬菜腌制過程中多為桿菌，如膜醋酸桿菌、黑醋酸菌和紅醋酸菌等[1]。孟憲剛等[15]采用傳統分離鑒定法對發酵蔬菜漿水中優勢好氧微生物進行研究，得到8株酵母菌和1株細菌，初步鑒定酵母菌歸入3個屬，分別是酒香酵母屬、瓶形酵母屬和假絲酵母屬；將細菌初步歸為醋酸桿菌屬。

1.4 霉菌

霉菌是真菌的一部分，菌絲發達，在蔬菜腌制過程中為有害菌，會導致蔬菜組織軟化，口感變差，引起嚴重腐敗，霉菌的大量繁殖也會影響蔬菜的外觀。在蔬菜腌制過程中常見的霉菌主要有青霉、交鏈孢霉、鐮刀霉等[1]。楊珺等[10]采用常規微生物培養方法，對四川榨菜后熟階段微生物區進行研究，分離得到的細菌分別歸于9個屬，12種菌，其中霉菌鑒定出2個屬，分別是青霉屬和曲霉屬。

1.5 其他細菌

在蔬菜腌制的初期還有另外一些細菌活動，如大腸桿菌、丁酸菌、丙醋桿菌和丙醋梭菌等[1]。何鵬暉等[16]以發酵蔬菜為研究對象，采用16S rDNA對其中形成腐敗膜醭的主要微生物進行鑒定研究，利用胰蛋白胨大豆瓊脂培養基分離培養發酵蔬菜腐敗膜醭中的微生物，挑取50株單克隆回接到發酵鹽鹵胰蛋白胨培養基中培養，將能夠在培養液表面顯著形成膜醭的菌株進行鑒定，共分離鑒定出6株細菌，分別為枯草芽孢桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、科氏葡萄糖球菌科氏亞種、普羅威登斯菌、克雷伯氏桿菌屬和陰溝腸桿菌。

2 影響腌制蔬菜中微生物的環境因子

2.1 鹽度

腌制蔬菜含鹽量一般為泡酸菜0～4%、咸菜類10%～14%、糖醋菜1%～3%、鹽漬菜25%。大多數微生物細胞滲透壓力為3.54×105～1.62×106Pa，1%的食鹽產生1.8×104Pa的滲透壓。3%～5%的食鹽抑制大多數腐敗細菌，10%的食鹽對乳酸菌、大腸桿菌、丁酸菌產生抑制作用，酵母菌耐鹽性較強，受鹽度影響較小。李軍波[17]采用自然發酵和強化發酵2種發酵方式對2%、5%、8%(w/v)3種食鹽濃度的泡菜進行了研究并發現了：(1)2%食鹽濃度中乳酸菌的繁殖代謝最快；5%濃度能較好地抑制真菌和大腸桿菌的繁殖；8%濃度減緩了乳酸菌的繁殖代謝。(2)鹽濃度低于2%時，食品乳桿菌緩慢生長；鹽濃度高于2%時，食品乳桿菌的生長受到抑制，數量也逐漸降低。但相比于植物乳桿菌和腸膜明串珠菌，食品乳桿菌的耐鹽性更好。

2.2 溫度

微生物都需要適宜的溫度才能正常的生長繁殖。乳酸菌活動的最適溫度為26～30℃，醋酸菌適宜溫度為25～30℃、酵母菌適宜溫度為25～28℃、大多數霉菌適宜溫度為25～30℃。腌制過程中的發酵溫度應該保持在12～22℃之間，既保證了乳酸菌的發育，又能抑制腐敗菌的繁殖。腌制過程中難免有雜菌產生，比如丁酸菌的適宜溫度是35℃，為了延長腌制蔬菜的保質期，應將貯藏環境溫度降低，最好放冰箱里。

2.3 酸度

蔬菜腌制中幾種主要微生物所能忍受的最低pH為：霉菌1.2～3.0、丁酸菌4.5、大腸桿菌5～5.5、乳酸菌3.0～4.4、腐敗細菌4.4～5.0、酵母菌2.5～3.0[1]。所以一般在腌制后熟階段，把腌漬液的pH控制在4.5以下，就能控制有害微生物的生長繁殖。

2.4 氣體成分

蔬菜腌制時一般都要壓緊或密封，或者用鹽水淹沒來隔絕空氣。因為乳酸菌是兼性厭氧菌，在隔絕空氣狀態下能進行正常的發酵，而以霉菌為主的有害微生物都是需氧菌，通過隔絕空氣的措施可抑制它們的生長發育，來保證腌制蔬菜的品質。

2.5 蔬菜品種

蔬菜本身提供的營養物質，是乳酸菌進行發酵作用的條件之一。原料蔬菜中營養物質含量多少會影響發酵速度和酸性產物的生成。相同條件下，含糖量越多的蔬菜能令乳酸發酵越快。一般用于腌制的蔬菜，含糖量在1.5% ～3%比較合適，如果發酵效果不明顯，可以適當添加一些糖。

3 腌制蔬菜微生物的鑒定技術

腌制蔬菜微生物的鑒定技術見附表。

3.1 傳統菌種鑒定技術

傳統的菌種鑒定技術有菌落形態觀察、革蘭氏染色、鞭毛染色、糖類分解試驗、吲哚(靛基質)試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、接觸酶試驗等。傳統的細菌學檢驗與鑒定的主要依據是形態特征和生理形狀進行細菌培養及一系列生化反應或免疫學檢測。方法復雜費時，對有些細菌也往往不能給出理想的結果。

3.2 聚合酶鏈式反應技術(PCR)

PCR技術是1985年由MULLIS發明的一種聚合酶鏈式反應技術，是DNA的體外擴增技術，原理類似于DNA的體內復制過程，需要模版DNA、寡核苷酸引物、DNA

附表 腌制蔬菜菌群鑒定技術

聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)原料和合適的緩沖液體系，在一定的溫度下，經過重復的過程，就能完成DNA的體外合成。PCR技術的優點是能在短時間內將目的基因進行擴增，以便對已知DNA片段進行分析。以PCR技術為基礎的PCR-DGGE技術和實時熒光定量PCR技術在發酵蔬菜的微生物研究有廣泛應用。

3.2.1PCR-DGGE技術 PCR-DGGE技術是近幾年比較熱門的分子鑒定技術，它主要是通過在電泳凝膠中加入尿素和甲酰胺等變性劑，從而區分相同長度不同序列的DNA片段。DGGE技術可以用于特定菌的存在，也能發現沒有被分離鑒定的菌種，還能監測菌群結構的變化，在食品微生物分析中應用廣泛。但是PCR-DGGE也有缺點，它對含量較低的菌群無法檢測，也很難區分相似度高的菌種。為了確保分辨率，用于DGGE分析的PCR產物一般要求長度在500bp以下。DGGE技術的缺陷是電泳的共遷移現象會對測序結果有所影響。荊雪嬌等[25]采用PCR-DGGE技術，分析了市售9種發酵蔬菜中細菌菌群結構，結果表明，所有的發酵蔬菜中均存在植物乳桿菌，但在醬菜中含量比較少；另外含量較多的還有短乳桿菌、彎曲乳桿菌、消化乳桿菌和食用糖乳桿菌；在不同加工工藝中，泡菜工藝下真菌群落結構穩定性最高；酸菜工藝下真菌群落結構穩定性最差。

3.2.2實時熒光定量PCR技術 實時熒光定量PCR技術是在DNA擴增反應中加入熒光基團，每次聚合酶鏈式反應的進行，熒光信號會逐漸累積，循環后測出產物總量的方法，該技術能夠使整個PCR反應過程被實時監測，然后通過標準曲線可以對未知的模版進行定量分析。熒光定量PCR技術精度高，在發酵食品中主要菌群的分布及豐度，發現新的微生物具有重要意義。

3.3 基因測序技術

基因測序技術的發展可分為三代：毛細管電泳測序技術、高通量測序技術、單分子測序技術。

3.3.1第一代測序技術 第一代測序技術的理論依據是Sanger建立的“DNA雙脫氧鏈末端終止測序法”和Maxam-Gilbert 化學降解法。Sanger法利用雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)比dNTP缺少3’-OH，能使引物與目的DNA的延伸反應停止這一原理建立4個反應，分別加入足量的4種dNTP和不同的被同位素標記的ddNTP，通過聚合酶合成能與目的DNA互補的片段，由于ddNTP的存在，會形成不同長度的DNA延伸片段，將4個反應的產物分4個泳道用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，便可以按順序讀出相應的DNA序列。熒光標記技術出現后，逐漸取代同位素標記技術，在Sanger法中，可以用不同熒光標記4種ddNTP，在一個泳道的尿素變性的PAGE膠上電泳分析，然后通過檢測不同波長的信號，用計算機分析信號后即可獲得目的DNA的堿基序列。Maxam-Gilbert化學降解法其原理是將目的DNA片段的5’端作放射性標記，然后設計5個獨立的反應，每個反應中分別用不同試劑將目的DNA切割成重復的堿基片段，通過凝膠電泳分離，根據不同條帶的顯示情況，可以分析出各片段末端堿基，從而確定目的DNA的堿基序列。

化學降解法與Sanger法相比，是直接用目的DNA的片段來進行電泳分析，而不是通過酶合成的與目的DNA互補的片段進行測序，能夠有效避免酶合成出錯導致測序結果偏差。但化學降解法的操作過于復雜，漸漸被Sanger法代替。

3.3.2第二代測序技術 高通量基因測序技術是對毛細管電泳技術一次革命性的改變，高通量測序設備運行一次可以實現對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，每次運行所獲得的數據量是Mbp。目前，高通量測序平臺的代表有羅氏公司的454 測序儀、美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺、ABI公司自主研發的SOLiD 測序儀[23]。

孫慧君等[20]采用Illumina高通量測序方法對27份傳統發酵錦州小菜微生物多樣性進行研究，共檢測到5種已知細菌門，53種細菌屬，乳桿菌屬、藍細菌屬是優勢菌屬；檢測出的20種真菌屬中，2種酵母菌目屬、Hyphopichia屬、畢赤酵母屬為優勢菌屬，青霉菌屬在所有樣品中測出。

侯強川等[24]采用454焦磷酸測序技術對采集自俄羅斯埃利斯塔市郊的2份發酵蔬菜樣品中的細菌進行了分析，分別獲得了10 869和12 204條高質量序列。經過與RDP數據庫比對，結果表明，乳桿菌屬占細菌總數的91.66%，成為絕對優勢菌，乳球菌屬占細菌總數的3.81%，成為次級優勢菌。另外，還鑒定出了弧菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、克魯維菌屬等。

3.3.3第三代測序技術 Helicos單分子測序儀、Pacific Bioscience的SMRT技術(圖1)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術(圖2)，這三種技術被稱為第三代測序技術[38，40]。不同于第二代測序依賴于DNA模版和PCR擴增，采用邊合成邊測序的方法，第三代測序方法具有更高通量、更短時間、更精確等優點。

韓琬[26]采用單分子測序技術對日本清酒曲樣品細菌和真菌多樣性進行研究，結果顯示，共有39 121條高質量序列生成，通過序列分析將這些基因序列歸類為5格細菌門和2格真菌門，優勢菌門分別為變形菌門和子囊菌門。

圖1 SMRT 技術原理[25]

圖2 納米孔單分子測序技術原理[27]

4 結論

蔬菜腌制是一種冷加工方式，相比于熱加工，在風味和營養價值上都有巨大的優越性。隨著經濟發展和生活水平的提高，人們對營養健康的高品質腌制蔬菜的需求也與日俱增。腌制蔬菜的品質取決于發酵微生物，因此，對傳統腌制蔬菜的微生物研究及控制顯得越來越重要。

從目前我國對傳統發酵蔬菜中優勢菌群的多樣性研究方法來看，傳統分離鑒定法依然占據主導，分離出的菌群種類和數量少，很多菌種都無法檢測出。因此，基因測序技術的完善和推廣變得越來越重要，基因測序技術精度高，簡便快捷，能鑒定出大量傳統分離鑒定法無法檢測的菌株，有利于加深我們對傳統發酵蔬菜中微生物菌群的了解，進一步闡明發酵蔬菜品質形成的機制。但是每種方法本身也有局限性，比如DGGE技術的電泳共遷移現象；高通量測序在測序前要通過PCR手段擴增，因此增加了測序的錯誤率等，所以在進行微生物多樣性分析時，合理選擇不同方法進行結果比較顯的尤為重要。但筆者覺得在不久的將來，伴隨著基因測序技術的成熟，對腌制蔬菜菌群變化的研究也將更加深入?！?/p>