儲藏時間對大豆分離蛋白結構及凝膠性質的影響

劉寶華，劉勝囡，田 翔，牛念念，李新宇，李 楊，江連洲，于文華

(1東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2山東萬得福實業集團有限公司，山東東營 257000)

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)以低溫變性脫脂豆粉為原料，經堿提酸沉等工序處理后得到的蛋白質[1]。蛋白質凝膠是溶液中的蛋白質分子通過有規則地交聯而形成的占據原溶液空間的網狀結構[2]。利用SPI的凝膠特性，可將其添加到火腿、腸等食品中，從而可改變產品質構特性，提高產品對水分、油類和風味物質等的保持能力[3]。在儲藏過程中，SPI的品質會隨著儲藏時間的延長而逐漸發生改變，從而影響利用SPI生產的產品品質穩定性，進而極大程度地限制了商用SPI在食品領域內的應用。近年來,關于儲藏時間對SPI結構及凝膠性質影響的研究較少，國內主要集中在儲藏條件對SPI功能性質影響的研究上，如石彥國等[4-5]對貯藏的環境以及包裝材料和氧氣含量進行了研究；郭鳳仙[6]研究了貯藏條件、原料及加工損失對蛋白貯藏穩定性的影響；Chun Liu等[7]研究了大豆蛋白在不同儲藏條件下的功能性質變化；Vilene等[8]研究了儲藏溫度對不同水分活度大豆分離蛋白理化特性的影響。但目前國內外鮮有關于儲藏時間對SPI結構及凝膠性質影響的研究報道。因此，本文模擬SPI的商業倉庫儲藏環境，重點研究儲藏時間對SPI結構及凝膠性質的影響，解析SPI結構變化對其凝膠性質的影響，以期為解決儲藏期內SPI凝膠性質改變提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質量分數89.21%)，山東萬得福實業集團有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，北京索寶來試劑公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

F-4500熒光分光光度計，日本日立公司；LD5-10型低速離心機，北京德世科技有限公司；K60型食品調理機，德國博朗；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立公司；Healthcare SE260 電泳儀，美國GE公司；MAGNA-IR560傅里葉紅外光譜，美國尼高麗公司；TA.XTPLUS質構儀，英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1大豆分離蛋白的儲藏 將SPI采用PE膜真空袋(10cm×15cm，最大氧氣通透率為48cm3/(m2·24h·atm)，最大H2O 6.86g/(m2·24h·atm))包裝，置于25℃恒溫箱中儲藏。儲藏時間為150d，每隔30d對SPI性質進行分析。

1.3.2羰基含量的測定 參考Levine等[9]的方法對樣品的羰基含量進行測定。將0.35mL樣品溶液與1mL含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，20℃水浴保溫2h。另取0.35mL樣品溶液與1mL不含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，同樣20℃水浴保溫2h，作為空白。隨后向每個離心管內加入0.45mL 40%三氯乙酸，劇烈搖勻后靜置20min，10 000g離心20min后棄去上清液，隨后用1.5mL乙醇-乙酸乙酯混合溶液(1∶ 1，v/v)洗滌沉淀，然后10 000g離心10min棄去洗滌液，重復洗滌沉淀3次。最后懸浮于1.0mL 0.1mol/L含6mol/L鹽酸胍pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，37℃水浴20min，每間隔5min劇烈振搖1次。以空白為對照在367nm處作校正，以22 000mol/(L·cm)為消光系數計算每mg蛋白質羰基衍生物的摩爾數。

1.3.3表面疏水性的測定 表面疏水性采用ANS熒光探針法[10]進行測定。將樣品溶于0.01 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，調節蛋白濃度分別為0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.40、0.50mg/mL，取4.0mL上述蛋白溶液，加入20μL濃度為8.0mmol/L的ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)溶液(用0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制得到)，混勻后迅速測定其熒光強度。設定激發波長和發射波長分別為390nm和470nm，激發和發射狹縫寬均為5nm，以未加ANS溶液的相應濃度的蛋白溶液的熒光強度作空白。樣品的熒光強度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對熒光強度值。以相對熒光強度對蛋白質濃度作圖，其初始斜率作為蛋白質的表面疏水性指數(H0)。

1.3.4氨基酸組成分析 準確稱取30～50mg樣品(精確至0.000 1g)至訂制的水解管中，加入10mL 6mol/L HCl溶液，隨后將水解管用氮氣吹掃15min，用酒精噴燈封管，隨后置于110℃烘箱中水解22～24h后取出，待冷卻到室溫后將樣品過濾至50mL容量瓶中，并用純水洗滌水解管和濾紙3次，收集合并洗滌液和濾液于容量瓶中，定容后準確量取1mL樣品于60℃真空脫酸濃縮后，加入1mL檸檬酸鈉緩沖液，用震蕩混勻器混合均勻，經0.2～0.45μm濾膜過濾后用氨基酸自動分析儀測試。

1.3.5SDS-PAGE凝膠電泳 采用SDS-PAGE凝膠電泳對大豆分離蛋白樣品中7S、11S含量進行測定，具體實驗方案如下：取20μL樣品加入20μL含β-巰基乙醇的4X上樣緩沖溶液中，煮沸5min。分別配置濃度為12%(w/v)的分離膠和濃度為5%(w/v)的濃縮膠，樣品添加量為10μL。電泳過程恒壓，濃縮膠和分離膠的電壓分別為80V和120V。染色液為0.1%考馬斯亮藍R-250(甲醇︰冰乙酸=4∶ 1∶ 5)的混合溶液，脫色液為(甲醇∶ 冰乙酸∶ 水=4∶ 1∶ 5)混合溶液。

1.3.6大豆分離蛋白凝膠的制備 將大豆分離蛋白與水(1∶ 4，w/v)倒入食品調理機中進行預處理，處理結束后將混合物在3 500r/min下離心13min，85℃恒溫水浴鍋中加熱45min，冷卻至室溫后將其在4℃條件下冷藏8h以完全形成凝膠。冷藏結束后，制成厚度為30mm的凝膠塊，用于質構測定。

1.3.7大豆分離蛋白凝膠質構性質的測定 大豆分離蛋白凝膠強度采用TA.XTPLUS質地分析儀進行測定，測定參數為穿刺模式、p/0.5 探頭，測試前速率1 mm/s、測試速率2 mm/s、測試后速率10 mm/s、感應力5 g，壓縮程度80%，測定溫度為室溫，每個樣品重復3次測定，取其平均值作為最終結果。凝膠強度測試完畢后，調整TA.XTPLUS質地分析儀的分析程序，測定凝膠塊的硬度，測定參數為TPA模式、測試前速率1 mm/s、測試速率5 mm/s、測試后速率5 mm/s、感應力5 g、測試前速度距離10 mm。

1.3.8紅外光譜 依據Mantsch[11]的方法對不同儲藏時間的樣品進行紅外光譜測試。稱取樣品2 mg，加入溴化鉀100 mg，壓片后進行測定。在25℃條件下，掃描波數譜段范圍為4 000～400 cm-1，波數精度為0.01 cm-1，掃描次數為64次，譜圖利用Peakfit Version軟件進行處理。

1.4 數據統計方法

每組試驗都進行3次平行試驗，采用Origin 8.5和PeakFit 4.12軟件分析數據并作圖。利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 儲藏時間對SPI樣品羰基含量的影響

SPI中羰基含量的多少可以反映其被氧化的程度，由于SPI的羰基衍生物通常來源于賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)等氨基酸殘基的氧化，或來源于蛋白骨架斷裂的產物(α-酰胺化反應)，因此，SPI的蛋白質羰基含量增加通常表明其發生了氧化反應[12]。由圖1可知，隨著儲藏時間的延長，SPI羰基含量逐漸升高，說明SPI在儲藏過程中發生了氧化反應。在SPI的制取過程中，大豆細胞結構的破壞會使多不飽和脂肪酸易被脂肪氧合酶催化而產生脂質過氧化反應，進而生成自由基和活性次生氧化產物，可能會誘導SPI氧化[13]。工業上生產SPI所采用的原料為低變性脫脂豆粕，其中含有1%左右的殘余脂質，工業化生產SPI的過程中存在高溫加熱過程，可能會導致這些油脂發生氧化生成脂質過氧化物，進而發生自由基鏈式反應，從而生成大量自由基，所生成的自由基可能攻擊蛋白質使其氧化[14]。SPI的制備過程中會涉及原料與攪拌器以及噴霧干燥器等設備的接觸，從而有可能向SPI中引入金屬離子，并與過氧化物反應產生自由基進而導致蛋白質氧化[15]。也有可能是PE膜真空袋中存有微量氧氣，在儲藏過程中，誘導SPI發生了氧化反應。蛋白質的氧化可使其氨基酸側鏈和蛋白質多聚肽骨架發生一系列變化，如蛋白質斷裂、交聯、伸展和構象的改變[16]。

圖1 儲藏期內大豆分離蛋白羰基含量變化

2.2 儲藏時間對SPI表面疏水性的影響

蛋白質的疏水作用是一種配位體間非共價鍵相互作用。Boatright等[17]發現，蛋白質發生氧化后會使其表面疏水性下降。黃友如[18]研究發現，蛋白質的表面疏水性會隨著蛋白質氧化程度的加劇而逐漸下降。由圖2可知，隨著儲藏期延長，SPI的表面疏水性逐漸降低，這可能是由于SPI發生氧化反應，較大程度地促進了聚集物的形成，從而使蛋白表面疏水性氨基酸逐漸包埋于分子內部，降低了大豆蛋白表面疏水性。吳偉[2]研究發現，脂質過氧化產物可以氧化SPI疏水側鏈基團，進而使蛋白質部分去折疊，暴露出的疏水基團在疏水相互作用和氧化共價交聯的共同作用下可生成氧化聚集體，從而降低蛋白質的表面疏水性。此外，儲藏期內SPI表面疏水性的下降也有可能是由于親水基團(羰基)形成，蛋白質聚集以及疏水性殘基的暴露引起的結構修飾[19]。

圖2 儲藏期內SPI表面疏水性變化

2.3 儲藏時間對SPI氨基酸組成的影響

如表1所示，由于在預處理過程中采用了濃HCl水解樣品，從而使色氨酸(Trp)被完全破壞，且天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的酰胺基被水解，因此表1中沒有Trp、Asn和Gln的含量。在氧氣及金屬離子(Fe3+)的作用下，由于自由基傳遞反應的發生，使得蛋白質肽鏈中氨基酸殘基損傷以及肽鍵斷裂，從而使蛋白質發生氧化。一般參與氧化反應的有N-末端的α-氨基、Pro、Arg和Lys側鏈以及半胱氨酸(Cys)。由表1可知，Cys、Arg和Lys的含量隨著儲藏時間的延長而逐漸降低，由此可推測，在儲藏過程中發生了氧化反應使得Arg和Lys側鏈被氧化生成羰基。吳偉[2]研究發現，經ROO·、HPODE和丙烯醛分別氧化后，大豆蛋白的游離氨基和有效賴氨酸含量顯著下降(P<0.05)。Liu等[20]研究發現，蛋白質經ROO·氧化處理后，其Lys殘基的ε-氨基可轉變為羰基，再與蛋白質的氨基反應進一步生成西佛堿，從而使蛋白質的游離氨基和有效賴氨酸含量發生下降。相關性分析表明，酪氨酸(r=0.144，P<0.05)、半胱氨酸(r=0.877，P<0.05)、苯丙氨酸(r=0.480，P<0.05)、賴氨酸(r=0.956，P<0.05)、精氨酸(r=0.814，P<0.05)和脯氨酸(r=0.825，P<0.05)含量與表面疏水性呈正相關。

表1 儲藏期內SPI氨基酸含量變化

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖3可知，儲藏30 d后，7S和11S亞基條帶顏色明顯加深，條帶變寬，而在30～150 d儲藏過程中，7S和11S亞基條帶并未發生顯著變化，且在儲藏過程中并沒有新的蛋白質聚合物生產。自由基可通過奪氫、加氧、偶合以及裂解等反應直接誘導蛋白質發生氧化，從而使蛋白主肽鏈斷裂、側鏈基團氧化以及形成共價交聯物[15]。而吳偉[2]通過對大豆蛋白進行AAPH、HPODE和MAD氧化，結果表明，隨著AAPH、HPODE和MAD濃度的增大，大豆蛋白的亞基條帶顏色呈現不同程度的變淺，并在分離膠頂部出現聚集體條帶。由此推測，本試驗在模擬倉儲環境儲藏下，SPI的氧化反應并不劇烈，肽鏈未出現顯著斷裂。

圖3 儲藏期內SPI的SDS-PAGE電泳

2.5 大豆分離蛋白紅外光譜分析

FT-IR光譜的研究可以定量給出樣品中蛋白質的二級結構。由圖4、表2可知，在儲藏初期，大豆蛋白的結構是以β-折疊為主，其含量為37.42%。儲藏0～60 d時，無規則卷曲的含量逐漸下降，說明蛋白質趨向于一種有序的狀態，而α-螺旋和β-折疊的含量總體呈現上升的趨勢。由于α-螺旋和β-折疊埋藏在蛋白質分子內部，從而在0～60 d內蛋白質的表面疏水性會下降。儲藏60～120 d時，無規則卷曲含量逐漸上升，α-螺旋和β-折疊的含量逐漸下降，蛋白質趨向于一種無序狀態。當儲藏時間達到150d時，α-螺旋含量下降至13.78%，β-折疊上升至42.48%，無規則卷曲含量下降至15.57%，從而推測該階段蛋白質趨向于一種有序狀態，但大量的α-螺旋和β-折疊包埋在分子內部導致蛋白表面疏水性呈下降趨勢，從而分子間疏水作用力下降。吳偉[2]通過研究脂質過氧化產物對SPI結構的影響，發現蛋白質氧化會導致SPI的α-螺旋含量下降，并伴隨著聚集體和共價交聯物的生成。由此可推測，儲藏期內SPI的二級結構逐漸發生改變。

圖4 儲藏期內SPI的紅外光譜

圖5 儲藏期內大豆分離蛋白酰胺Ⅰ帶的擬合圖譜

2.6 儲藏期對SPI凝膠性質的影響

在大豆蛋白凝膠形成的過程中，7S的β亞基與11S的堿性亞基有選擇地進行相互作用，并直接影響著大豆蛋白的凝膠性，11S蛋白質的酸性亞基對凝膠網狀結構的形成具有重要作用。蛋白凝膠形成時，受熱會使蛋白分子分散，憎水基團暴露并由氫鍵、二硫鍵等結合形成特殊的網狀結構，因此大豆蛋白的結構決定了其凝膠的形成過程。由圖6可知，在0～60 d時，SPI凝膠的凝膠強度及硬度逐漸下降，在60～120 d時，其凝膠強度及硬度又逐漸上升，在150 d時，下降至最低值。SPI凝膠的凝膠強度及硬度變化規律與其二級結構相似，由此可推測，儲藏期內SPI二級結構的改變會進而影響其凝膠性質。由表1可知，隨著儲藏時間的延長，半胱氨酸的含量逐漸降低，而蛋白質氧化可以改變半胱氨酸的氧化還原狀態，改變巰基和二硫鍵的數量和分布[21]。

表2 儲藏期內SPI的二級結構含量

圖6 儲藏期內大豆分離蛋白的凝膠性質變化

吳偉等[22-23]研究發現，隨著蛋白質氧化程度的加深，凝膠硬度逐漸下降，這是由于蛋白質氧化使得維持其凝膠硬度的主要作用力(二硫鍵)降低。這主要是由于蛋白質氧化導致二硫鍵向游離巰基轉變，隨著蛋白質氧化過程的持續，這種游離巰基被不斷氧化，最終變為不可逆狀態[2]。Ooizumi等[24]研究發現，蛋白質氧化聚集會破壞大豆蛋白結構的穩定性，進而降低大豆蛋白凝膠的強度和持水性，改變其微觀結構。還可能是由于隨著儲藏時間的延長，-SH基團被脂肪氧合酶催化產生的脂質氫過氧化物部分氧化，進而使通過-SH/-S-S-交換反應形成的分子間二硫鍵數量降低[25]，從而導致SPI凝膠強度及硬度下降。相關性分析表明，SPI凝膠強度與表面疏水性(r=0.592，P<0.05)，凝膠硬度與表面疏水性(r=0.793，P<0.05)均呈正相關。

3 結論

將SPI采用PE膜真空袋包裝，25℃儲藏0、30、60、90、120、150d，研究儲藏時間對SPI結構及凝膠性質的影響，結果發現，隨著儲藏時間的延長，SPI的羰基含量逐漸上升，表明SPI在儲藏過程中發生了氧化反應；隨著儲藏時間的延長，SPI的表面疏水性下降，氨基酸含量發生改變，且紅外光譜結果表明，儲藏期內SPI的二級結構發生改變；儲藏0～60d時，SPI凝膠強度及硬度隨著儲藏期的延長而逐漸減弱，60～120d時，凝膠強度及硬度逐漸增強，當儲藏時間達到150d時，凝膠強度及硬度降至最小值，SPI凝膠性質的變化規律與其二級結構相似，且其凝膠強度及硬度的數值均與表面疏水性呈正相關。◇