核桃肽對小鼠的抗疲勞作用

烏 蘭，劉 睿，杜 倩，陳啟賀，任金威，樊 蕊，李 勇

(北京大學公共衛生學院營養與食品衛生系，北京 100191)

疲勞是機體一種復雜生理生化的變化過程，對人們的健康狀態、生存質量和工作效率會產生許多不良影響，嚴重時甚至會威脅人們的身心健康。隨著現代生活節奏的加快，社會競爭的加劇，由于工作、學習的壓力，使得疲勞成為困擾許多人的健康問題。由于疲勞的持續或反復發作，嚴重影響著人們正常的個人活動和社會行為，甚至長期累積疲勞引起“過勞死”，即由于過度疲勞而導致死亡的案例也屢見不鮮[1-2]。不論在我國還是世界其他國家，疲勞現象早已引起了人們的關注。因此，探討具有緩解疲勞、抗疲勞作用的保健食品具有極其重要的現實意義。

核桃是我國由來已久的藥食兩用食品。我國食用核桃的歷史悠久，且是核桃的發源地，從秦漢時期起一直被我國人民作為藥食兩用食品，明代的《本草綱目》記載：“核桃味甘性平微苦微澀，有補腎固精、健脾補血、通便潤腸、寧心安神等功效”[3]。現代研究發現，核桃中不僅含有豐富的蛋白質、糖類、脂肪類成分，更含有人體需要的不飽和脂肪酸、維生素E、黃酮、葉酸、多酚類等多種生理活性成分。其中，核桃蛋白是一種具有經濟、食用及藥用價值的優質植物蛋白，富含豐富的營養成分，核桃中蛋白質含量約為15%，核桃蛋白中含有18種氨基酸，8種必需氨基酸種類齊全，其組成比與人體必需氨基酸含量近似，氨基酸組成中精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸等含量相對較高[4]。研究發現，核桃蛋白具有抗氧化、抑菌、抗病毒、降血壓、抗腫瘤等功效[5]。核桃中含有多種生物活性肽，作為一種天然活性肽，其安全性高，具有極好的應用前景。段心妍[6]實驗證明，核桃肽可以有效促進雄性SD大鼠體力疲勞的恢復。賈靖霖等[7]研究了核桃多肽對小鼠負重實驗的影響，結果表明，小鼠負重游泳力竭時間和血清尿素氮的含量差異均極顯著，表明核桃多肽具有抗疲勞作用。傳統觀點認為，食物中的蛋白質必須在消化道中被分解成游離氨基酸才能夠被機體吸收利用，發揮其營養價值。近些年研究發現，動物消化道中蛋白質水解終產物大多是由10個或10個以下氨基酸殘基組成的小分子低聚肽，不需消化分解成游離氨基酸便可直接以低聚肽的形式被機體吸收利用，比單個氨基酸的吸收更為有效，對提高蛋白質的利用率有重要作用[8]。伴隨著生物化學和分子生物學技術的飛速發展，有關低聚肽的研究正逐漸引起人們的重視。但有關核桃低聚肽的抗疲勞作用尚無文獻報道，故本實驗通過應用不同劑量的核桃低聚肽溶液對小鼠進行的飲水干預，探討核桃肽對小鼠抗疲勞的作用。乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時保留在上清液中的多種蛋白質組分的統稱，包含多種蛋白及大量生物活性物質，具有增強體質、提高免疫力、抗疲勞等多種功效[9]。本實驗設置乳清蛋白對照組是為避免單純蛋白質攝入量的提高對結果的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

核桃肽，淡黃色固體粉末，主要成分為分子量小于1 000的低聚肽，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量較多，購自北京天肽生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級ICR雄性小鼠240只，18～22g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。飼養于SPF級動物室，溫度范圍為22±2℃，相對濕度為50%～60%，晝：夜明暗交替時間為12h：12h。實驗期間動物自由進食。

1.3 實驗方法

1.3.1分組及處理 動物適應性喂養1w后，按體重隨機分為5個組：1個空白對照組、1個乳清蛋白組[220mg/(kg·BW)]和3個核桃肽干預組[110、220、440mg/(kg·BW)]。每日經飲水給予受試樣品，空白對照組給予高壓消毒蒸餾水，乳清蛋白組和核桃肽干預組給予相應濃度受試物，核桃肽和乳清蛋白溶液均用蒸餾水配制。動物每周稱重2次，按體重調整受試樣品劑量。受試樣品給予時間30d。實驗過程中每周觀察各組小鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態、攝食及日常活動情況等。

30d干預結束后，每組隨機分為A、B、C、D 4個亞組，A亞組進行各組小鼠血乳酸水平的檢測；B亞組檢測各組小鼠血清尿素氮含量、乳酸脫氫酶活力及血糖水平；C亞組為負重游泳實驗，記錄小鼠負重游泳力竭時間；D亞組檢測小鼠肝糖原和肌糖原含量。

1.3.2血乳酸測定 小鼠尾尖采血20μL，隨后不負重在30℃的水中游泳10min。再于游泳后0和20min分別采血20μL。將3次采得的血樣分別加入0.48mL質量分數為1%的NaF溶液中充分混勻至透明，加入1.5mL蛋白沉淀劑，震蕩混勻，3 000r/min離心10min，取上清液測定血乳酸含量。

采用自配試劑測定血乳酸含量，主要原理為在銅離子催化下，乳酸與濃硫酸在沸水中反應，乳酸轉化為乙醛，乙醛與對羥基聯苯反應產生紫色化合物，在波長560nm處有強烈的光吸收，故可進行定量測定。

1.3.3血清尿素氮和乳酸脫氫酶、血糖水平的測定 在30℃的水中不負重游泳90min，休息60min后眼球采血。置4℃冰箱約3 h，血凝固后2 000r/min離心15min，取血清備用。根據試劑盒說明書進行尿素氮、乳酸脫氫酶和血糖水平的測定。

1.3.4負重游泳實驗 置小鼠在游泳箱(大小約50cm*50cm*40cm)中游泳。水深不少于30cm，水溫25±1.0℃，鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負重游泳時間。

1.3.5肝糖原和肌糖原測定 處死D組動物，取新鮮肝臟和肌肉組織樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，精確稱重，根據試劑盒說明書進行檢測。

1.4 統計方法

2 結果與分析

2.1 核桃肽對小鼠體重的影響

各組小鼠開始體重和結束末次體重相比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

組別只數初次體重(g)末次體重(g)空白對照組4825.73±1.4639.08±2.47乳清蛋白組4825.40±1.9439.21±3.03低劑量組4825.18±1.6139.37±2.38中劑量組4825.18±1.5639.07±2.96高劑量組4824.95±1.4939.89±3.68

2.2 核桃肽對小鼠血乳酸含量的影響

取A亞組12只小鼠，測定小鼠血乳酸水平。如表2所示，游泳前，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血乳酸含量均大于空白對照組(P<0.01)；游泳后20min，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血乳酸含量均顯著小于空白對照組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，且核桃肽中、高劑量組小鼠游泳后20min血乳酸含量均顯著小于乳清蛋白對照組(P<0.01、P<0.01)；核桃肽高劑量組血乳酸曲線下面積小于空白對照組(P<0.05)。

組別游泳前血乳酸值游泳后0min血乳酸值游泳后20min血乳酸值血乳酸曲線下面積值空白對照組4 240.48±1 295.497 302.38±1 383.257 700.00±1 102.50207 738.10±25 954.21乳清蛋白組5 664.94±1 523.437 283.12±1 128.885 709.09±1 287.67194 662.34±27 169.33低劑量組6 378.57±980.037 633.33±768.575 273.81±567.71a199 130.95±9 942.78中劑量組6 735.71±2 072.468 835.71±1 128.235 019.05±570.30ab216 404.76±24 982.36高劑量組6 895.24±1 895.076 930.95±1 694.364 759.52±663.10ab186 035.71±24 646.60c

注：a與空白對照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；b與乳清蛋白對照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；c與空白對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

2.3 核桃肽對小鼠血清尿素氮、乳酸脫氫酶活性和血糖的影響

核桃肽中、高劑量組小鼠血清尿素氮均低于空白對照組(P<0.01、P<0.05)；核桃肽低劑量組小鼠乳酸脫氫酶活性高于乳清蛋白對照組(P<0.05)；核桃肽低、中、高劑量組小鼠血糖水平明顯高于乳清蛋白對照組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)(表3)。

組別尿素氮(mmol/L)乳酸脫氫酶(U/L)血糖(mmol/L)空白對照組21.13±12.381 971.29±578.626.15±2.82乳清蛋白組14.17±5.051307.71±333.038.43±1.71低劑量組16.57±11.161 834.26±810.03c5.82±1.61d中劑量組11.99±1.63b1 348.14±399.125.33±2.22d高劑量組12.56±1.28a1 277.23±347.055.19±1.90d

注：a與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.01)；c與乳清蛋白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；d與乳清蛋白對照組比較差異有顯著性(P<0.01)

2.4 核桃肽對小鼠負重游泳時間的影響

空白對照組與乳清蛋白對照組小鼠平均負重游泳時間相比較無顯著差異(P>0.05)；核桃肽低、高劑量組游泳時間比空白對照組有顯著延長，分別是空白對照組的2、1.7倍(P<0.01、P<0.05)(附圖)。

附圖 核桃肽對小鼠負重游泳時間的影響注：a與空白對照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；b與空白對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

2.5 核桃肽對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

如表5所示，核中劑量組小鼠肌糖原含量高于空白對照組小鼠(P<0.05)，其他無顯著性差異。

組別肝糖原含量(mg/g)肌糖原含量(mg/g)空白對照組4.72±2.742.24±0.50乳清蛋白組7.66±2.372.63±0.35低劑量組6.25±1.642.40±0.44中劑量組5.25±1.283.06±1.22a高劑量組5.55±2.042.26±0.58

注：a與空白對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

3 討論

軀體性疲勞是由運動引起機體一系列生化改變而導致的肌肉力量下降。抗疲勞，即延緩疲勞的產生或加速疲勞的消除。疲勞的發生及其發展變化過程伴隨著一系列生化指標的改變[10]。故本實驗通過檢測血乳酸、乳酸脫氫酶活性、血清尿素氮和肝、肌糖原等生化指標以及負重游泳的時間，來探討核桃肽對小鼠的緩解疲勞作用及其可能的機制。

乳酸是劇烈運動時碳水化合物在無氧條件下的糖酵解產物，在正常情況下血中乳酸濃度可維持在一定水平。隨著高強度運動的增加，更高水平的乳酸可引起H+濃度的增加，并改變內部pH。pH下降會影響細胞內相關酶的活性，同時還會抑制肌質網對鈣離子的釋放和攝取，產生疲勞[11]。乳酸的消除途徑基本包括三種[12]，即在乳酸脫氫酶作用下，乳酸轉化為丙酮酸隨后氧化分解成二氧化碳和水；在肝和骨骼肌內重新合成葡萄糖和糖原；在肝內合成脂肪酸等其他物質。在本研究中，服用核桃肽低劑量組的小鼠乳酸脫氫酶活性高于乳清蛋白對照組，但該組小鼠血乳酸含量并未明顯下降，可能是核桃肽并未全部通過乳酸脫氫酶途徑消除掉體內產生的乳酸。但核桃肽高劑量組血乳酸含量有所下降，可提示核桃肽有減緩疲勞的作用。

血清尿素氮是腎功能能量代謝的產物，較長時間運動后，當糖、脂肪代謝不能供給機體足夠的能量時，蛋白質和氨基酸分解代謝加強，導致機體中血尿素氮含量增加。體內尿素氮和身體耐力之間呈正相關。即表示身體承受運動耐力越差，尿素氮水平增加越多，故血清尿素氮是評估疲勞水平的敏感指標[13]。本研究中核桃肽中、高劑量組小鼠血清尿素氮水平均低于空白對照組，表明核桃肽可減少血清中尿素氮的堆積，可提示核桃肽有提高身體承受運動耐力的能力，能有效緩解疲勞。

糖是人體最重要的能源物質，主要包括肌糖原、肝糖原和血糖。其中，肌糖原是維持肌肉運動的重要能源，肝糖原分解是血糖維持穩定的重要保障[14]。正常運動時機體的能量提供主要來自于糖原的分解，糖原儲備量對于運動具有十分重要的作用，因此肝糖原和肌糖原是與疲勞相關的敏感指標[15]。研究發現，肌糖原消耗增加時，機體將分解肝糖原產生葡萄糖進入血液，以維持血糖水平。但是當肝糖原儲備耗竭時，機體不能維持正常的血糖水平，也會導致大腦產能不足，從而功能受抑制[16]。在本研究中，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血糖水平明顯高于乳清蛋白對照組，提示核桃肽可提高一定程度的血糖水平，提高緩解疲勞能力。核桃肽中劑量組小鼠肌糖原含量高于空白對照組小鼠，可提高肌糖原儲備，提高運動耐力，達到抗疲勞作用。

疲勞的最主要表現是運動耐力的下降，運動耐力是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標[10]。負重游泳實驗是評估身體耐受力最常用的動物模型實驗，且減少疲勞的敏感性與游泳時間相關[17]。負重游泳時間越長，表示抗疲勞的能力越強。本次研究中，核桃肽低、高劑量組游泳時間比空白對照組有顯著延長，表明核桃肽提高了小鼠的運動耐力，即提高了小鼠的抗疲勞能力。此外，本實驗中核桃肽低劑量組干預僅提高了乳酸脫氫酶活性和負重游泳時間，核桃肽中劑量組干預可增加小鼠肌糖原含量，而核桃肽高劑量組干預可改善與疲勞相關的多個指標，如血乳酸含量、血清尿素氮含量及負重游泳時間，可能提示干預效果與劑量之間存在線性關系。

以上結果表明，核桃肽可通過減少體內乳酸的堆積降低血乳酸水平，通過延長負重游泳時間和有效清除血清尿素氮的含量提高身體承受運動耐力的能力，通過提高肌糖原的含量穩定維持肌肉運動的能力來源，從而起到提高小鼠抗疲勞能力的作用。

綜上，本實驗通過對小鼠進行核桃低聚肽的干預，發現了核桃低聚肽對小鼠的抗疲勞作用，但其中機制未能明確，需根據進一步的研究進行探討。

4 結論

綜上所述，本研究通過設立空白對照組和乳清蛋白組作為對照組，探討核桃肽的抗疲勞作用。結果表明，核桃肽可提高乳酸脫氫酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原儲備量，顯著延長負重游泳時間，具備一定的緩解疲勞的作用。但未能明確核桃肽抗疲勞作用的機制，其有待進一步的探討。◇