解郁安神顆粒對卒中后抑郁小鼠模型的抗抑郁作用*

鄒龑，杜源，傅風華，

(1.山東中醫藥大學藥學院，濟南 250014；2.煙臺大學藥學院，煙臺 264005)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是最常見的腦血管疾病并發癥，是卒中后出現的以思維緩慢、情感低落、語言動作遲滯為主要表現的情感障礙性疾病[1]，其卒中后發病率29%～70%[2]。PSD是一種繼發性情感障礙，嚴重阻礙患者肢體功能和認知功能恢復，增加病死率[3]。針對PSD本虛標實的特點，臨床治療中多應用疏肝益氣、活血解郁法組方用藥[4-5]。

PSD的發病機制尚不明確。經典的單胺遞質假說認為PSD的發生與去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)單胺遞質的水平降低密切相關[6]。此外，5-羥色胺1A受體(5-HT1Areceptor，5-HT1AR)在大腦海馬內分布最為廣泛，且與抑郁發生密切相關，是臨床抑郁癥藥物治療的重要靶點[7]。目前臨床上以選擇性5-羥色胺再攝取抑制藥(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRIs)為一線用藥，例如西酞普蘭、氟西汀等[8-9]。解郁安神顆粒(JieyuAnshengranule，JY)為中藥成方制劑，其處方組成為柴胡、大棗、石菖蒲、半夏(制)、白術(炒)、浮小麥、遠志(制)、甘草(炙)、梔子(炒)、百合、膽南星、郁金、龍齒、酸棗仁(炒)、茯苓、當歸。其功效為疏肝解郁，安神定志。本研究旨在評價JY對PSD小鼠抑郁樣行為學，以及對海馬單胺神經遞質水平及5-HT1AR表達的影響，研究其抗抑郁作用及機制，為JY的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠，雄性，8周齡，體質量30～35 g，由濟南朋悅實驗動物繁育公司提供，許可證號：SYXK(魯)20140007。自由攝食和飲水，飼養環境22～24 ℃，相對濕度為40%～60%。

1.2藥品與試劑 JY(通化利民藥業集團有限公司，規格：每袋5 g，批號：140607；艾司西酞普蘭片(丹麥靈北藥廠生產，西安楊森制藥有限公司分裝，規格：每片10 mg，批號：151218117)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號 ：20130426)；羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110809)。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)(批號：100169-201404)、DA(批號：100070-201507)及5-HT(批號：111656-200401)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3方法 PSD小鼠模型參照相關文獻[10-11]，采用雙側頸總動脈線栓再灌聯合慢性不可預知性溫和刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)制備。具體操作：動物用烏拉坦麻醉后固定，頸部用聚維酮碘消毒，在其正中線作一縱行切口，鈍性分離皮膚以及皮下組織，分離雙側頸總動脈，用止血鉗夾閉雙側頸總動脈阻斷血流5 min，隨后松開止血鉗使血復灌10 min，再次用止血鉗夾閉雙側頸總動脈阻斷血流5 min，隨后松開止血鉗，將切口縫合，消毒操作區域。在腦缺血后第2天起，進行CUMS以建立PSD模型，包括：4 ℃ 冰水游泳、過夜照明、禁水、禁食、夾尾、潮濕墊料及合籠。共計7種刺激方法。每天1或2種，連續刺激18 d。除正常對照組外，將PSD模型小鼠隨機均分為模型對照組，艾司西酞普蘭組(5 mg·kg-1)，JY 小、中、大劑量組(JY0.75，1.50及3.00 g·kg-1)，每組12只。正常對照組及模型對照組給予空白溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)，其余各組每日灌胃給藥1次，連續給藥28 d，給藥體積均為10 mL·kg-1。

1.4抑郁樣行為學檢測

1.4.1強迫游泳實驗 實驗在第20天進行。正式實驗前小鼠在實驗室首先適應環境至少1 h，然后將小鼠放入強迫游泳實驗裝置(高35 cm，直徑15 cm的透明圓柱形桶，水深35 cm)，使小鼠在水中前爪攀附于缸壁，并且不能以后爪支撐身體為標準，15 min后取出動物。正式實驗時，將動物置于強迫游泳實驗裝置，保持水溫(25±2) ℃。觀察6 min，記錄后5 min內累計不動時間。

1.4.2懸尾實驗 實驗在第21天進行。采用小鼠專用懸尾箱(30 cm×30 cm×40 cm，內有固定吊環)，距尾尖2 cm處用醫用膠布固定于吊環上，使其頭部距離地面15 cm。實驗時懸掛6 min，記錄累計不動時間。

1.5小鼠海馬NE、DA及5-HT水平檢測 給藥結束后，將小鼠處死，取腦，于冰上迅速剝離海馬組織，稱濕重，以1：9加入0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分勻漿，再向勻漿液中加入其二分之一體積的6%高氯酸，充分渦旋， 4 ℃下16 000 r·min-1離心20 min(r=7.1 cm)。吸取上清液100 μL，過孔徑0.45 μm濾膜濾過后用高效液相色譜法進行檢測。

色譜條件：色譜柱為SHIMADZU VP-ODS C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；水相為0.01 mol·L-1醋酸鉀緩沖液，流動相為甲醇-水(10：90)，用0.2 mol·L-1檸檬酸調pH值至4.0等度洗脫；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長：275 nm。NE，DA及5-HT的保留時間分別為3.37，5.02及10.08 min。

1.6小鼠海馬5-HT1AR表達檢測 實驗結束后，將小鼠處死，取腦，于冰上迅速剝離海馬組織，稱取海馬組織20 mg，加入RIPA裂解液250 μL，于冰上勻漿，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min(r=7.1 cm)，收集上清液，即為蛋白，測定蛋白濃度。隨即將上清液加入5倍上樣緩沖液，煮沸10 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳后進行轉膜，隨即5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入5-HT1AR一抗于4 ℃過夜孵育。TBST洗膜10 min × 3 次，加入二抗常溫孵育1 h，同法洗膜，放入凝膠成像系統，曝光攝像。圖像分析用ImageQuant LAS 4000軟件計算吸光度值(A)。

2 結果

2.1JY對PSD小鼠抑郁樣行為的影響

2.1.1JY對PSD小鼠游泳不動時間的影響 見圖1，與正常對照組比較，模型對照組小鼠游泳不動時間明顯增加(P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組及JY小及中劑量組小鼠游泳不動時間明顯減少(P<0.05)，JY大劑量組小鼠游泳不動時間有一定程度減少，但差異無統計學意義。表明PSD小鼠絕望不動的時間明顯增加，其表現出明顯的絕望情緒；而給藥后PSD小鼠不動時間減少，說明艾司西酞普蘭及JY(小、中劑量)均能明顯改善PSD小鼠的絕望情緒。

與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.1.2JY對PSD小鼠懸尾不動時間的影響 見圖2，與正常對照組比較，模型對照組小鼠懸尾不動時間明顯增加(P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組及JY中、大劑量組小鼠懸尾不動時間明顯減少(P<0.05)。結果表明PSD小鼠絕望不動時間明顯增加，其表現出明顯的絕望情緒；而給藥后PSD小鼠的不動時間減少，說明艾司西酞普蘭組及JY(中、大劑量)均能明顯改善PSD小鼠的絕望情緒。

2.2JY對PSD小鼠海馬NE、DA及5-HT水平的影響 見表1。與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬NE、DA及5-HT水平明顯均降低(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組小鼠海馬5-HT，JY中劑量組小鼠海馬NE、DA及5-HT，以及JY大劑量組小鼠海馬NE水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。結果表明PSD小鼠海馬NE等單胺類神經遞質水平均明顯降低；而JY中、大劑量能明顯增加PSD小鼠海馬NE等單胺類神經遞質水平，其對NE、DA及5-HT水平均有明顯上調作用。艾司西酞普蘭僅能明顯增加PSD小鼠海馬5-HT水平。

與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

表16組小鼠海馬NE、DA及5-HT水平比較

Tab.1ComparisonofNE，DAand5-HTinhippocampusamongsixgroupsofmice

組別NEDA5-HT正常對照組47.48±4.144.49±0.140.67±0.12模型對照組33.31±3.84*13.55±0.08*20.38±0.05*1艾司西酞普蘭組44.95±7.793.25±0.410.74±0.07*3JY小劑量組45.74±4.393.64±0.280.46±0.07JY中劑量組47.75±3.34*44.92±0.62*40.53±0.06*4JY大劑量組55.88±4.56*33.40±0.330.46±0.06F26.53242.25840.523

與正常對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與模型對照組比較，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05，*2P<0.01；compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

2.3JY對PSD小鼠海馬5-HT1AR表達的影響 見圖3。與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬5-HT1AR表達明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，JY中、大劑量組小鼠海馬5-HT1AR表達均明顯升高(P<0.01)。結果表明PSD小鼠海馬5-HT1AR表達明顯降低；而JY中、大劑量均能夠明顯上調PSD小鼠海馬5-HT1AR表達。

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01

3 討論

PSD是發生于卒中之后的郁證，是在卒中基礎上出現以情緒低落、興趣減少、缺乏主動性、悲觀、失望、食欲不振等癥狀[12]。中醫學將其歸屬“郁證”與“卒中”之合病，該病病因為肝郁氣滯，病理基礎為肝腎衰弱，病理特點為肝腎下虛，風痰阻絡[13]。西醫對PSD的發病機制尚不明確，目前普遍接受包括神經內分泌機制和社會心理學機制[14]。抗抑郁藥物可以快速有效地治療PSD，顯著改善患者的認知和預后，已成為治療PSD的重要手段[15]。SSRIs是PSD的治療首選藥物，但大都需2～4周才能充分顯效，且存在一定不良反應。中醫藥近年來在治療PSD方面卓有成效，且因不良反應少易被人們接受。

PSD動物模型目前多采用卒中伴抑郁的復合模型，經典制備方法為結扎(或線栓)后聯合CUMS模型，符合人腦卒中后抑郁的病理特點[16]。因此本研究采用雙側頸總動脈線栓再灌注法制備腦缺血小鼠模型，再給予CUMS聯合制備PSD小鼠模型，其表現出絕望等抑郁核心癥狀。

絕望情緒是PSD患者臨床表現的重要癥狀[17]。強迫游泳和懸尾實驗是抑郁樣行為學中評價藥物抗抑郁作用的經典方法[18]。強迫游泳實驗是利用動物無法逃脫水淹而誘導產生絕望行為，懸尾實驗是利用動物無法克服不正常體位而誘導產生絕望行為，二者使動物產生絕望情緒的機制有一定差別[19]。本研究中，PSD小鼠在掙扎后表現出不動狀態，其“無助”的行為程度能夠反映其絕望狀態。因此，在懸尾實驗中，通過對PSD小鼠不動狀態的行為學檢測，包括游泳不動時間和懸尾不動時間，評價動物的抑郁樣行為。本研究發現，艾司西酞普蘭及JY均能明顯減少PSD小鼠的游泳不動時間及懸尾不動時間。因此，艾司西酞普蘭及JY均能明顯逆轉PSD小鼠的絕望情緒。

PSD發病機制中經典假說為單胺類遞質系統失衡假說，即單胺類神經遞質系統功能低下，尤其是NE及5-HT等單胺類遞質水平的低下[20-21]。海馬是參與調節情感、認知、行為的重要中樞[22]。NE、5-HT及DA作為中樞系統極其重要的神經遞質，均可參與情感、情緒、行為、痛覺及睡眠等多項生理功能的調節[23]。以往研究發現PSD大鼠海馬組織5-HT、NE 及DA水平與正常大鼠及單純卒中大鼠比較均顯著降低[24]。5-HT1AR主要分布于與情感調節密切相關的邊緣系統(尤其分布于海馬神經元和齒狀回的突觸后膜)，其功能異常與PSD的發生密切相關[22]。據報道[25]，與正常動物比較，抑郁動物模型的海馬5-HT1AR表達顯著降低，抗抑郁藥能夠通過上調抑郁動物海馬5-HT1AR表達發揮抗抑郁的作用。本研究發現，PSD小鼠海馬5-HT1AR表達明顯降低，而JY能夠明顯上調其海馬5-HT1AR表達，表明JY發揮抗抑郁的作用應與上調其海馬5-HT1AR表達有關。

綜上所述， JY對PSD小鼠的抑郁樣行為具有明顯的改善作用，可明顯逆轉PSD小鼠的絕望情緒，同時PSD小鼠海馬NE等單胺類神經遞質水平及5-HT1AR表達明顯升高，說明JY對PSD小鼠模型具有抗抑郁的作用，其抗抑郁作用可能是通過提高海馬NE、DA及5-HT水平，以及上調海馬5-HT1AR表達來實現的。