TNF-α、FoxM1在結直腸癌組織中的表達及相關性分析

眭文妍 范曉慧 陳麗紅 趙文麗 彭曉峰

【摘要】 目的：研究在結直腸癌（CRC）組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與叉頭框轉錄因子M1（FoxM1）的表達情況并分析其相關性。方法：選取2017年10月-2018年10月本院收治的CRC患者60例。所有患者均經手術治療，術后均留取病灶標本（CRC組織），并取遠離癌組織中心5 cm以上的組織為對照標本（癌旁組織）。以Western blot法檢測CRC組織與癌旁組織TNF-α與FoxM1中的表達情況，并分析TNF-α與FoxM1在CRC組織中的相關性。結果：CRC組織TNF-α、FoxM1蛋白相對表達量均高于癌旁組織（P<0.05）;組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及有淋巴結轉移、侵及漿膜層及以外的CRC組織TNF-α與FoxM1蛋白相對表達量均分別高于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes A、B期，以及無淋巴結轉移及未侵及漿膜層的CRC組織（P<0.05）;TNF-α與FoxM1呈正相關（r=0.587，P<0.05）。結論：TNF-α、FoxM1的高表達與CRC的發生、發展有關，且兩者有明顯的正相關，可為CRC的診斷及預后判斷提供指導，并能作為新的治療研究靶點。

【關鍵詞】 結直腸癌; 腫瘤壞死因子-α; 叉頭框轉錄因子M1; 相關性

Expression and Correlation Analysis of TNF-α and FoxM1 in Colorectal Cancer Tissues/SUI Wenyan，FAN Xiaohui，CHEN Lihong，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（26）：119-122

【Abstract】 Objective：To study the expression of TNF-α and FoxM1 in colorectal cancer（CRC）and to analyze their correlation.Method：60 patients with CRC admitted to our hospital from October 2017 to October 2018 were selected.All patients were treated with surgery，and all lesions were collected postoperatively（CRC tissue），and tissues more than 5 cm away from the center of cancer tissue were taken as control specimens（adjacent tissue）.The expression of TNF-α and FoxM1 in CRC tissues and adjacent tissues were detected by Western blot，and the correlation between TNF-α and FoxM1 in CRC tissues was analyzed.Result：The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues were higher than those in adjacent tissues（P<0.05）.The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues with differentiation degree Ⅲ，Ⅳ level，Dukes C，D period，lymph node metastasis，invasion into serous layer and beyond were higher than those in CRC tissues with differentiation degree Ⅰ，Ⅱ level，Dukes A，B period，no lymph node metastasis and no serous layer invasion，respectively（P<0.05）.TNF-α was positively correlated with FoxM1（r=0.587，P<0.05）.Conclusion：The high expression of TNF-α and FoxM1 is related to the occurrence and development of CRC，and they are positively correlated.They can provide guidance for the diagnosis and prognosis of CRC，and can be used as new therapeutic research targets.

【Key words】 Colorectal cancer; Tumor necrosis factor-α; Fork frame transcription factor M1; Correlation

First-authors address：Huizhou First Peoples Hospital，Huizhou 516003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.26.032

結直腸癌（CRC）是臨床常見的消化道腫瘤，也是全球三大最常見的癌癥之一，其死亡率居于惡性腫瘤死亡的第4位，近年來我國的結直腸癌發病率呈逐年升高，已經成為威脅我國居民健康的常見腫瘤[1]。目前手術輔助放化療是CRC的主要治療方式，但患者的5年生存率仍較低，隨著臨床對腫瘤標志物研究的深入，通過尋找CRC的特異性標志物進行精確的靶向治療成為臨床的重要研究內容[2]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由脂肪組織中的單核-巨噬細胞系統分泌，也是發現最早的能使腫瘤組織發生出血性壞死的細胞因子，已經成為腫瘤靶向治療的新靶點之一[3]。叉頭框轉錄因子M1（FoxM1）是一種與增殖相關的轉錄因子，是預測CRC患者無瘤生存期及總生存期的重要指標[4]。本研究主要對CRC組織中TNF-α、FoxM1的表達及相關性進行分析，為CRC的靶向治療策略提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月-2018年10月本院收治的60例CRC患者，納入標準：均為原發性結直腸癌，且經結腸鏡活檢、臨床病理切片證實，符合《中國結直腸癌診療規范（2015版）》中對結直腸癌的診斷標準[5]。排除標準：伴有心、肝、腎等重要器官功能異常、伴有急慢性感染性疾病者;在病理檢查及手術治療前接受過相關放療、化療及其他輔助治療者。60例CRC患者中男34例，女26例;年齡42～85歲，平均（65.2±7.5）歲;組織分化程度：Ⅰ級10例、Ⅱ級26例、Ⅲ級20例、Ⅳ級4例;Dukes分期：A期12例、B期25例、C期15例、D期8例;淋巴結轉移38例、未轉移22例;浸潤漿膜層及以外35例、未侵及至漿膜層25例。所有患者入院后均經手術治療，術后均留取病灶標本（CRC組織），并取遠離癌組織中心5 cm以上的組織為對照標本（癌旁組織）。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 試劑：兔抗人FoxM1多克隆抗體為圣克魯斯生物技術（上海）有限公司（SANTA CRUZ Biotechnology Inc）產品，EN Vision免疫組化檢測試劑盒[由賽默飛世爾（中國）科技有限公司]。方法：CRC組織與癌旁組織TNF-α、FoxM1蛋白表達檢測：以10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片。Western blot檢測TNF-α、FoxM1蛋白表達情況，取適量組織加入裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）勻質裂解后反復離心，取上層清液提取蛋白，以BCA蛋白定量法進行蛋白濃度檢測，100 ℃水浴鍋中煮沸5 min使蛋白質變性，配置10%聚丙烯酰胺凝膠（SDA-PAG），每孔中加入蛋白與加樣緩沖混合液適量，垂直電泳分離，將含TNF-α、FoxM1與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的膠段切下移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以5%脫脂奶粉密封6 min后分別加入20 mL FoxM1（1︰300）與GAPDH（1︰3 000）一抗稀釋液，于4 ℃環境下過夜，次日洗膜完全后加入二抗稀釋液（1︰3 000）室溫下孵育1 h，洗膜完全后以ECL發光液進行顯影，以Image J進行灰度值分析，目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值記為相對表達量。

1.3 觀察指標 （1）對比CRC組織與癌旁組織的TNF-α、FoxM1蛋白相對表達量。（2）比較不同病理參數的TNF-α、FoxM1蛋白表達情況。主要比較不同組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、浸潤程度患者的TNF-α及FoxM1蛋白表達情況。（3）分析TNF-α與FoxM1在CRC組織中的相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，使用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α及FoxM1表達情況比較 CRC組織中TNF-α與FoxM1蛋白的蛋白相對表達量均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 不同病理參數的CRC組織中TNF-α、FoxM1蛋白表達情況比較 組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達量高于Ⅰ、Ⅱ級，差異均有統計學意義（P<0.05），Dukes分期C、D期TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達量高于A、B期（P<0.05），有淋巴結轉移的TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達量高于未轉移（P<0.05），侵及漿膜層及以外的TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達量高于未侵及漿膜層，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 相關性分析 經Pearson相關性分析，在CRC組織中TNF-α與FoxM1蛋白表達呈正相關（r=0.587，P=0.010）。

3 討論

隨著社會的發展進步，人們的生活水平逐漸提高，各種高糖、高脂肪及高熱量食物的攝入量增多，另外受吸煙、肥胖及缺乏鍛煉等因素影響，結直腸癌的發病率逐漸增加[6]。結直腸癌早期的癥狀并不明顯，多數患者就診時已進入晚期，其病情進展快，預后差，病死率高，因此如何提高對結直腸癌的診斷、治療效果具有重要意義[7-8]。已知結直腸癌發生涉及眾多因子的相互作用，并與基因突變有一定的關系，因此分析靶向治療成為本病治療的新途徑，探討結直腸癌的新型腫瘤標志物和治療靶點成為結直腸癌治療的研究熱點[9-10]。

本研究結果顯示CRC組織中的TNF-α及FoxM1蛋白相對表達量均高于癌旁組織（P<0.05），說明TNF-α與FoxM1蛋白的高表達與CRC的發生有關;組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及有淋巴結轉移、侵及漿膜層及以外的CRC組織TNF-α與FoxM1蛋白相對表達量分別高于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes分期A、B期，以及無淋巴結轉移、未侵及漿膜層的CRC組織（P<0.05），且經Pearson相關性分析TNF-α與FoxM1蛋白相對表達呈正相關（P<0.05），說明TNF-α與FoxM1的蛋白表達水平與臨床病理特征有關，參與CRC的病理發展過程，兩者可相互影響。有研究表明，腫瘤的微環境由腫瘤細胞、間質細胞（炎性細胞、成纖維細胞）、趨化因子等共同參與，而炎癥細胞是其重要組部分，因此在結腸癌的發展、發展過程中起到促進作用[11-12]。TNF-α作為與腫瘤相關的細胞巨噬細胞分泌的因子，可啟動機體的慢性炎癥，通過激活和轉錄因子κB和活化蛋白1兩種炎性信號通路關鍵因子，促進細胞的增殖和逃逸，從而促進腫瘤細胞的定植[13-14]，還能穩定腫瘤上皮間質轉化的相關轉錄因子Snail，促進腫瘤的轉移[15-17]。有研究顯示內源性分泌的TNF-α可誘導成纖維細胞分泌蛋白酶，破壞間皮表層，促進腫瘤細胞的浸潤，破壞間皮表層導致腫瘤發生浸潤，并能通過調控中性粒細胞的基因表達，促進腫瘤的轉移和生長。FoxM1是叉頭盒蛋白家族的重要成員，在結腸、小腸、睪丸、胸腺等成人組織分裂活躍的細胞中均有表達，在靜止期活分化的細胞中幾乎不表達，能通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體促進結直腸癌細胞的侵襲、分化、轉移及浸潤[18-19]。因此相較于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes A、B期，以及未發生淋巴結轉移及未侵及漿膜層的CRC組織中，組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及發生淋巴結轉移、侵及漿膜層及以外的CRC組織中的TNF-α與FoxM1蛋白相對表達量更高。而TNF-α蛋白表達的異常升高，可促進腫瘤細胞的轉移、浸潤、定植，從而使FoxM1的表達量增加，因此兩者有正相關的關系[20]。

綜上所述，TNF-α與FoxM1均參與腫瘤的發生與發展，且兩者呈正相關，可成為CRC的診斷、預后監測因子及新型的治療靶點。

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（收稿日期：2019-02-18） （本文編輯：田婧）