雙波長高效液相色譜法同時檢測環孢素A及伏立康唑血藥濃度

王林軍

（新汶礦業集團有限責任公司中心醫院藥學部，山東 泰安 271233）

環孢素是目前移植領域最常用的免疫抑制藥物，其抗排異作用與用藥劑量密切相關，但該藥品不良反應多且與用藥劑量過大有關，故臨床需要對其進行血液濃度監測，以保證用藥安全有效[1]。患者在造血干細胞移植后的并發癥控制是提高惡性血液病療效的重要環節，而感染是導致移植失敗甚至致死的主要原因，因此，惡性血液病患者行造血干細胞移植后除了服用免疫抑制劑外，往往還需同時服用多種藥物[2-3]。當移植患者并發真菌感染時，多需聯合使用抗真菌藥物，其中伏立康唑屬廣譜三唑類抗真菌藥物，用于治療非中性粒細胞減少患者的念珠菌血癥，可有效治療原發性或急救性的亞急性侵襲性感染和慢性肺曲霉病等，美國感染病學會（IDSA）制訂的曲霉病治療指南中，伏立康唑是治療侵襲性曲霉病的首選藥物，移植患者出現該真菌感染后往往需合并使用該藥物，而該藥物在體內的代謝具有多態性，即使使用相同劑量，血藥濃度也因人而異，因此，該藥臨床使用同樣需要進行血液濃度監測[4-5]。此外，其與環孢素A聯合使用導致的藥品不良反應多有報道[6]。本研究中旨在建立一種快速、靈敏、準確且能同時測定兩藥血藥濃度的分析方法，為臨床監測其血藥濃度提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；208型Milli-Q10純水器 （美國Millipore公司）；AEG-120型電子分析天平（日本島津公司）；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機（湘儀儀器有限公司）。

1．2 試藥

環孢素A對照品（百靈威試劑公司，純度為99．7%）；伏立康唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100862-201701）；內標為醋酸可的松及熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為171217-201702，110709-201704）；乙腈（美國 Fisher公司）、醋酸銨（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170208）為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱：Diamonsil RP-C18柱（150 mm× 4．6 mm，5μm）；流動相：乙腈 -0．01mol／L 醋酸銨水溶液（65∶35）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35 ℃；檢測波長：215 nm（環孢素 A），256 nm（伏立康唑）；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，分別考察空白血清、環孢素A、伏立康唑標準品及血清樣品的色譜圖，結果血清中內源性雜質不影響環孢素A與伏立康唑的分離度，內源性物質無干擾，伏立康唑及環孢素A保留時間分別為5．32 min和6．48 min。詳見圖1。

2．2 溶液制備

標準溶液配制：稱取環孢素A 10．00 mg，伏立康唑對照品50 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，即得環孢素A質量濃度為1 g／L，伏立康唑質量濃度為5 g／L的對照品貯備液，于4℃下保存。取貯備液適量，用甲醇稀釋，配制系列濃度的對照品工作液待用。稱取熊果酸10．00 mg、醋酸可的松50 mg為內標，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得內標溶液（質量濃度分別為400 μg／mL和2 000 μg／mL ），于 4 ℃下保存。

圖1 高效液相色譜圖

表1 精密度及準確度試驗（n＝5）

血清樣品處理：量取血清樣品 200 μL，1．5 mL離心管中，隨即加入內標溶液10 μL，充分混勻，加入乙腈400 μL，渦旋振蕩 2 min，沉淀蛋白，以 12 000 r／min 的速率，離心 15 min，取上清液，氮氣吹干，200 μL流動相復溶，待分析。

2．3 方法學考察

標準曲線繪制：分別取不同質量濃度的環孢素A及伏立康唑標準溶液各100 μL，加入1 800 μL血清中，混勻，配置環孢素 A終質量濃度分別為 30，90，150，300，600，1 000，1 200，1 500 ng／mL 的標準曲線樣品；伏立康唑終質量濃度分別為 200，1 000，2 000，3 000，4 000，6 000，8 000，10 000 ng／mL 的標準曲線樣品。按血清樣品處理方法處理，以環孢素A或伏立康唑質量濃度為橫坐標、環孢素A或伏立康唑峰面積與內標面積比為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程，環孢素A為Y＝68．7 X＋6．241(r＝0．999 4，n＝8)，伏 立 康 唑 為Y＝264．1 X＋9．547(r＝0．999 2，n＝8)，環孢素 A 與伏立康唑質量濃度線性范圍分別為30～1 500 ng／mL和 200～10 000 ng／mL[信噪比（S／N）≥3]。

精密度試驗：分別配制環孢素A質量濃度為30，600，1 500 ng／mL，伏立康唑質量濃度為 200，4 000，10 000 ng／mL的血漿樣品，每個樣品平行配制5份，按血清樣品處理方法處理，按隨行標準曲線計算樣品濃度，考察方法學日內、日間精密度。結果見表1。環孢素A及伏立康唑日內、日間精密度均符合生物樣品檢測標準，RSD均小于15%(n＝5)。

準確度試驗：血漿樣品配制與操作方法同“精密度試驗”，結果見表1。可見，該方法準確度符合生物樣品檢測標準。

樣品穩定性：血漿樣品配制方法同“精密度試驗”，于室溫下放置 0，6，12 h 及 4 ℃下貯存 6，12，24 h 后，按血清樣品處理方法處理。結果見表2，可見，血清樣品在室溫存放12 h內和4℃存放24 h內穩定性均良好，RSD符合生物樣品檢測標準。

長期穩定性試驗：血漿樣品配制方法同“精密度試驗”，-20℃冷凍貯存，分別于第0，3，7天取出，樣品自然溶解后，按血清樣品處理方法處理。結果見表3，血清樣品在0～7 d內冷凍存放，穩定性良好，樣品的 RSD均小于15%(n＝5)，符合檢測標準。

表2 室溫及4℃血清樣品穩定性試驗結果（n＝5）

表3 血清樣品長期穩定性試驗結果（n＝5）

進樣待測樣品穩定性：血漿樣品配制方法同“精密度試驗”，按血清樣品處理方法處理，分別于進樣前將待測樣品于室溫下放置0，6，12 h及4℃下貯存6，12，24 h后再進樣檢測。結果見表4。可見，不同質量濃度進樣待測樣品在室溫條件下存放12 h以內及4℃條件下存放24 h的穩定性良好，樣品 RSD均小于15%(n＝5)，符合檢測標準。

表4 室溫及4℃條件下進樣待測樣品穩定性試驗結果（n＝5）

3 討論

環孢素A又稱環孢菌素A，為臨床常用免疫抑制劑，主要給藥途徑為口服或靜脈給藥，但口服吸收率低且不規則，且有顯著的肝、腎毒性，不同人群及個體口服給藥后血藥濃度差異大，臨床療效也有顯著差異，因此，有效監測血藥濃度是該藥減毒增效的必要手段。環孢素A主要通過肝藥酶CYP3A代謝，而CYP3A家族主要參與環孢素A代謝的CYP3A4和CYP3A5存在基因突變，可導致機體對環孢素的代謝加速，致血藥濃度降低，顯著降低療效[6-8]。此外，由于其主要有 CYP3A4及CYP3A5代謝，因此環孢素A與影響CYP3A的藥物合用時，可引起藥物相互作用，影響療效，甚至發生毒副作用[9-10]。伏立康唑是臨床治療危重真菌感染的一線用藥，移植患者易發生感染等并發癥，當發生真菌感染后多數患者使用伏立康唑。該藥物主要通過肝臟細胞色素P450 同工酶 CYP2C19，CYP2C9 和 CYP3A4 代謝[11]。其中CYP2C19是主要代謝酶，由于其基因多態性導致不同人群服用伏立康唑后體內血液濃度差異較大[12]。同時，該藥經CYP3A4代謝，當其與環孢素A聯用時，可導致環孢素A血藥濃度升高，引起毒性反應。有研究表明，兩藥合用可導致高血鉀反應[13]或癲癇樣反應[14-15]。因此，針對兩藥聯用的患者應進行有效的血藥濃度監測，但現有監測方法均為獨立監測2種藥物[16-18]，同一個血樣需采用不同的監測方法，效率低。此外，部分醫院不同的藥物樣品往往采取集中監測，導致2種藥物的監測結果存在時間差異，不能有效、及時地指導臨床治療。

本研究中建立的雙波長高效液相色譜法，其精密度、準確度、穩定性等符合標準，表明該方法可同時檢測血清樣品中環孢素A及伏立康唑的血藥濃度，節省檢測時間，為臨床同時監測兩藥提供了有效手段。