線性探針技術檢測肺結核患者耐藥情況臨床評價

侯 婧，韓 ，張 艷，孟 婧

（安徽省胸科醫院，安徽 合肥 230022）

耐藥肺結核患者的治療周期長、治療成本高、治愈率低，該病患者的增多[1]，進一步增大了傳播概率，也加重了社會的經濟負擔。然而，傳統的羅氏培養法培養結核分支桿菌需要8周[2]，進一步進行藥物敏感性試驗(簡稱藥敏試驗)診斷約需3個月，無法滿足及時診斷和早期合理用藥的需要[3]。線性探針（HAIN）技術通過對耐藥相關基因的PCR擴增和反向雜交，對利福平的耐藥基因rpoB和異煙肼的耐藥基因KatG及inhA進行檢測，從而可判斷結核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥性，并能在24 h內上報結果，已被世界衛生組織（WHO）推薦為一線抗結核藥藥敏試驗的“金標準”[4]。本研究中以結核分枝桿菌的羅氏培養和絕對濃度藥敏法為“金標準”，對HAIN技術檢測利福平和異煙肼耐藥性的效果進行評價，從而評估HAIN技術用于抗結核治療的臨床價值。現報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料

選取我院2016年1月至6月痰抗酸桿菌涂片陽性的住院患者 251例，年齡 15～85歲，平均（47．67±18．33）歲；男 187 例（74．50% ），平均年齡（50．17 ±17．32）歲 ；女 64 例 （25．50% ），平 均 年 齡 （40．39±19．40）歲。

1．2 試劑及儀器

羅氏培養與藥敏試驗使用珠海貝索生物技術有限公司固體羅氏培養基，結核分枝桿菌抗原采用杭州創新生物檢控技術有限公司試劑盒檢測，并應用Haier公司HR50-ⅡA2生物安全柜試驗。擴增及雜交選用德國Hain Life Sciences公司的 GeneType MTBDR-Plus1．0 Kit試劑盒。DNA雜交儀選用梅里埃公司的GT-Blot 48全自動微生物檢測系統。嚴格按照試劑盒及相關儀器配套說明書進行操作。

1．3 方法

患者晨起立即用清水漱口，采集其漱口后深咳出的膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質的痰液標本2份，一份采用羅氏培養及藥敏試驗檢測，一份應用HAIN技術檢測。

傳統羅氏培養及藥敏試驗：痰標本經2倍于標本量的消化液（4%氫氧化鈉）進行前處理，然后接種到酸性羅氏培養基培養。用接種環取一環培養基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對，制成質量濃度為1 g／L的菌懸液，梯度稀釋為10-2g／L和10-4g／L，分別接種含異煙肼（0．1 μg ／mL）和利福平（0．2 μg ／mL）的藥敏試驗培養基，放入細菌培養箱中，37℃培養6～8周，觀察結果。

HAIN技術檢測：利用超聲波水浴破壞細菌，提取DNA；應用熱啟動Taq酶擴增目的DNA片段；將PCR擴增產物與試紙條上固定的探針進行雜交顯色；利用酶顯色反應對結果進行判讀。以羅氏培養和藥敏試驗作為“金標準”，檢測HAIN技術下藥物的耐藥程度、敏感程度分別計算其敏感度、特異度。

1．4 統計學處理

采用SPSS 13．0統計學軟件分析，耐藥率比較采用χ2檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見表1至表2。以羅氏法為標準，HAIN技術對利福平及異煙肼耐藥檢測的靈敏度分別為87．69%和52．73%，特異度分別為 90．86%和 87．24%。

表1 HAIN法與羅氏法耐藥性檢測結果比較[例（%）]

表2 HAIN法與羅氏法藥敏試驗結果比較（例，n＝251）

3 討論

耐多藥（同時對利福平和異煙肼耐藥）結核病具有診斷難、治療難、傳播風險大的特點，是我國當前結核病控制的重點和難點。早期診斷可盡早控制耐藥結核病的傳播，同時能及時給予合理、有效的抗結核治療。傳統的羅氏培養法檢測結核分枝桿菌的藥物敏感性耗時長、工作量大，且在耐藥性檢測期間，只能根據經驗應用抗結核藥物，可能導致實施不合理的抗結核治療方案。顯然，尋找快速檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法已成為耐藥結核病控制的關鍵環節[5]?；蛐头椒ㄔ跈z測速度、操作標準化、潛在高通量及較低的生物安全條件等方面具有較大優勢，更適于大規模檢測耐藥結核[6]。HAIN技術能通過進行反向探針雜交技術快速檢測樣本中的結核分枝桿菌復合群（MTBC），并通過同時檢測rpoB，katG，inhA 3種基因，可在較短時間內檢測利福平和異煙肼的耐藥性，近幾年已在全世界廣泛應用[7-9]，該檢測整個周期僅為24 h，能快速得到耐藥性結果，確保更多結核病患者能得到快速、準確的診斷和治療[10]。

本研究中采用HAIN技術對不同性別及全部痰抗酸桿菌涂片陽性肺結核患者利福平、異煙肼的耐藥性進行檢測并與羅氏培養及藥敏試驗“金標準”進行比較，差異均無統計學意義（P＞0．05），說明2種檢測方法具有較好的一致性。但本研究中HAIN技術檢測利福平、異煙肼耐藥的敏感度及特異度均低于屈亞虹等[11]、李強等[12]報道的結果。究其原因，一方面，本研究中采用的是痰標本直接檢測，而其他研究多采用實驗室分離菌株進行檢測；另一方面，本研究中納入樣本數量較少，結果可能存在一定的選擇偏倚；此外，分子生物學技術對標本質量的要求較高，樣本中結核分枝桿菌數目較少或樣本中存在抑制DNA擴增的物質等，均可能影響檢測效果[13]。

本研究中，少數患者利福平耐藥檢測結果與文獻報道不一致，考慮原因為存在rpoB以外的基因突變[14]，呈假陰性；另外，部分結核菌株的rpoB基因突變位點為沉默或無效基因，此類基因不表達或低表達[15]，呈假陽性。

本研究中，HAIN技術對異煙肼耐藥性檢測的靈敏度及特異度均明顯低于利福平?？紤]可能是由于結核菌對利福平耐藥僅由rpoB單基因突變引起，而katG，inhA，ahpC等多個基因突變均可導致異煙肼的耐藥，HAIN技術僅檢測katG和inhA 2個基因判斷異煙肼的耐藥性，對 ahpC等其他可能導致耐藥的基因未進行檢測。有研究表明，ahpC突變可導致自身基因表達增強，進而補償KatG基因突變所導致的過氧化氫-過氧化物酶的缺乏，異煙肼活化不受影響，表型為敏感[16]。HAIN技術檢測的利福平耐藥率高于羅氏培養法，可能由于HAIN技術結果由肉眼直接讀出，會造成主觀偏倚[12]，同時操作過程中可能造成污染導致假陽性[17]。兩種檢測方法所得耐藥率均高于國內全國結核病耐藥性基線調查結果（8．32%）[18]，考慮可能是由于我院為安徽省的結核病診療中心，收住的復治及重癥肺結核患者較多，故耐藥率較高。

綜上所述，HAIN技術診斷的準確性、敏感度和特異度均較高，且能用于快速判斷利福平、異煙肼的耐藥性，可為早期發現耐多藥肺結核提供診斷依據，具有較大的臨床意義。臨床工作中在等待羅氏培養結果期間，可以HAIN技術作為輔助檢測手段，從而讓患者盡早得到合理、有效的抗結核治療。