高效液相色譜法測定余甘子提取物中沒食子酸與鞣花酸含量

張文莉 ，張俊儀 ，張龍開，黃月純，林偉斌，梁芷韻 ，魏 剛

（1．無限極 ＜中國 ＞有限公司，廣東 江門 529156； 2．廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州510006； 3．廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405； 4．廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006）

余甘子為大戟科植物余甘子 Phyllanthusemblica L．的干燥成熟果實，有清熱涼血、消食健胃、生津止渴功效，常用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉嚨痛及口干[1]。余甘子富含酚類、維生素、氨基酸、黃酮等生物活性物質[2]，主要有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化[6]、免疫調節等[7]藥理作用。近幾年的研究主要集中在藥物效應學與食品和保健品開發[8]。目前，余甘子藥材的質量控制方法主要有2015年版《中國藥典（一部）》收載的高效液相色譜（HPLC）法[1]。研究表明，余甘子藥材的質量與其來源、產地的地理環境、氣候、土壤等生長條件及采收加工方法關系較大[9-10]，提示藥典僅通過檢測沒食子酸含量控制余甘子質量專屬性不強。除沒食子酸外，余甘子尚含較多的鞣花酸、柯里拉京等多種酚酸類成分，采用特征指紋圖譜進行分析能更好地對余甘子進行質量評價[11-13]。余甘子提取物是由余甘子提取加工而成，常用作于藥品、保健品的原料。本研究中參考藥典余甘子標準檢測方法及文獻記載方法，對余甘子提取物中沒食子酸和鞣花酸含量進行測定，為評價其質量提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀（包括二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）；KQ-400 KDE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。10批余甘子提取物（編號S1～S10，來源見表1）；余甘子藥材，經廣州中醫藥大學魏剛研究員鑒定為大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblical．的干燥成熟果實；沒食子酸對照品（批號為110831-201605，純度為 89．9% ），鞣花酸對照品（批號為111959-201602，純度為 89．3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（Merck公司，色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 沒食子酸含量測定

2．1．1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0．2%磷酸溶液 （B）系統，梯度洗脫，0～10 min，A 為 2% →10% ，10～15 min，A 為 10% →20% ，15～20 min，A 為 20% →30% ，20～25 min，A 為30%→40%，25～35 min，A 為 40%→60%，35～40 min，A為60%→90%；檢測波長：273 nm；柱溫：30℃；流速：1．0 mL ／min；進樣量為 10 μL。

表1 余甘子提取物樣品來源

2．1．2 溶液制備

取樣品粉末0．2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲(功率為320 W，頻率為40 kHz)提取60 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含0．282 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。

2．1．3 方法學考察

專屬性試驗：取 2．1．2 項下 2 種溶液，按 2．1．1 項下色譜條件進樣測定。結果色譜峰分離度良好，峰形尖銳，符合含量測定要求(見圖1 A和圖1 B)。

線性關系考察：分別精密吸取2．1．2項下對照品溶液 1，2，5，10，15 μL，進樣分析，測定峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝2 914．6 X-15．21，r＝0．999 9（n＝5）。結果表明，沒食子酸進樣量在 0．282～4．230 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0．03%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品（S1）溶液10 μL，分別在室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定峰面積。結果的 RSD為 0．11%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

重復性試驗：分別精密稱取同一批樣品（S2）6份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果平均含量為37．15 mg／g，RSD 為 0．68% （n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取6份已知含量的樣品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品計算含量為 38．36 mg ／g），每份約0．1 g，精密稱定。然后分別精密加入一定量的對照品，依法制備供試品溶液，按2．1．1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表2。

2．2 鞣花酸含量測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxSB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0．2% 磷酸溶液（B）系統，梯度洗脫，0～10 min時A為40%→60%，10～15 min時A為60%→90%，15～20 min時A為90%；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1．0 mL ／min；進樣量 10 μL。

2．2．2 溶液制備

取樣品粉末0．2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取60 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取鞣花酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含鞣花酸0．043 6 μg 的溶液，搖勻，即得對照品溶液。

2．2．3 方法學考察

專屬性試驗：取 2．2．2 項下 2 種溶液，按 2．2．1 項下色譜條件進樣測定。結果色譜峰分離度良好，峰形尖銳，符合含量測定要求(見圖1A′和圖1B′)。

線性關系考察：分別精密吸取2．2．2項下對照品溶液 1，2，5，10，15 μL，進樣分析，測定峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、色譜峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝9 054．5 X-9．077，r＝0．999 9（n＝5）。結果表明，鞣花酸進樣量在 0．043 6～0．654 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0．26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品（S1）溶液10 μL，分別在室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時測定峰面積。結果的 RSD為0．38%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內穩定。

重復性試驗：分別精密稱取同一批樣品（S2）6份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果平均含量為13．52 mg／g，RSD 為 0．43% （n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取6份已知含量的樣品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品計算含量為 13．52 mg ／g），每份約為0．1 g，精密稱定，然后分別精密加入一定量的對照品，依法制備供試品溶液，按2．2．1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表3。

表2 沒食子酸加樣回收試驗結果（n＝6）

表3 鞣花酸加樣回收試驗結果（n＝6）

2．3 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5～10 μL，按擬訂色譜條件進樣分析，外標法測定含量。結果見表4。

表4 余甘子提取物含量測定結果（n＝2）

3 討論

2015年版《中國藥典（一部）》余甘子藥材質量標準中，采用HPLC法測定沒食子酸含量時的檢測波長為273 nm，本研究中以此測定余甘子中沒食子酸含量。而測定余甘子中鞣花酸含量的檢測波長254 nm是參考文獻確定的。

由于其酚酸類成分極性差異大，不同溶劑對沒食子酸、鞣花酸提取效果差異較大。本試驗中分別以不同體積分數甲醇為溶劑考察對沒食子酸和鞣花酸提取效果的影響，結果顯示，50%甲醇對沒食子酸提取效果明顯優于其他體積分數甲醇。而鞣花酸以甲醇為溶劑時提取率較高。本研究中參考2015年版《中國藥典（一部）》[1]及文獻[3]，擬訂分別以50%甲醇和甲醇為溶劑制備供試品溶液測定2種成分的含量。同時對2種成分的超聲時間（45，60，75 min）及取樣量（0．1，0．2，0．3 g）進行了優化篩選。結果顯示，提取時間和取樣量的改變對沒食子酸、鞣花酸的提取率均無明顯影響，故確定采用將提取物粉末0．2 g加入相應溶劑50 mL超聲提取60 min的方法制備供試品溶液。

沒食子酸和鞣花酸極性差異較大，采用梯度洗脫可同時測定其含量[3]，因所用溶劑不同，故對鞣花酸測定的流動相梯度進行了優化調整，縮短了保留時間。加樣回收試驗等方法學驗證表明，所建立的方法簡便可行。

根據含量測定結果判定，10批樣品中有2批為未知偽品，其沒食子酸與鞣花酸含量均為0。8批正品含量差異較大，沒食子酸含量為 12．79～105．07 mg／g，鞣花酸含量為 3．09～33．47 mg／g，最高與最低含量的差分別達8倍和10倍，提示市場上余甘子提取物質量差異較大。由于沒食子酸的專屬性相對較差，而藥典余甘子標準僅以沒食子酸含量作為定量指標，提示藥典余甘子質量控制指標專屬性不強。本試驗中所采用的沒食子酸結合鞣花酸含量測定方法，能更好地控制余甘子提取物的質量。

文獻對余甘子提取物的偽品報道較少，檢出的2批偽品暫未能確定其來源。但即使是正品，不同廠家產品含量差異也比較大，主要可能與藥材來源、制備工藝等相關。因此，應加強原料質量控制，規范穩定的制備工藝，才能更好地保障提取物質量的穩定性。