兩種PCR 法試劑盒用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)價(jià)值比較

張欣

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染性疾病，可侵犯人體多個(gè)臟器，尤以肺結(jié)核最為常見(jiàn)[1]。近年來(lái)我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其發(fā)病率及病死率在我國(guó)法定傳染病中居首位，已成為我國(guó)重點(diǎn)防治感染性疾病之一[2]。大量臨床報(bào)道提示[3-4]，早期準(zhǔn)確診斷治療對(duì)于改善結(jié)核病患者預(yù)后具有重要意義。目前臨床用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)常規(guī)采用抗酸染色法，但存在檢出陽(yáng)性率低、敏感性差等問(wèn)題，難以滿足臨床需要。近年來(lái)以PCR法為代表分子生物學(xué)檢測(cè)方法開(kāi)始被逐漸用于結(jié)核分枝桿菌輔助診斷，并逐漸獲得醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可。本文選取本院2015年3月—2018年8月收治確診結(jié)核病患者共120例，分別采用抗酸染色法、CapitalBio及Qiagen RTFQ-PCR試劑盒進(jìn)行結(jié)核分支桿菌檢測(cè)，比較不同組用于結(jié)核分支桿菌檢測(cè)陽(yáng)性率，旨在探討抗酸染色法、CapitalBio及Qiagen RTFQ-PCR試劑盒用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)臨床價(jià)值差異，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院2015年3月—2018年8月收治確診結(jié)核病患者共120例，其中男性67例，女性53例，年齡4～72歲，中位年齡為56歲，根據(jù)送檢標(biāo)本部位劃分，肺44例、乳腺10例，胸膜20例、淋巴23例，腎5例、胸椎8例、膀胱4例、膝關(guān)節(jié)3例、胸壁2例；全部組織均行HE、抗酸染色及PCR法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色法

常規(guī)抗酸染色后光鏡下觀察有無(wú)紅色、略彎曲桿狀或串珠狀桿菌存在，如有則報(bào)告陽(yáng)性[5]。

1.2.2 PCR法

選擇病灶范圍較廣且病變相對(duì)典型福爾馬林組織塊切片，切片厚度5 um，連切5～8張；根據(jù)說(shuō)明書(shū)完成DNA提?。徊捎冒步輦怣x2000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。結(jié)果判讀分別根據(jù)CapitalBio及Qiagen RTFQ-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄抗酸染色法和PCR法檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)，計(jì)算百分比；檢測(cè)陽(yáng)性率=（檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)）×100.00%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析選擇SPSS 24.0軟件；其中計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以（%）表示；當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法結(jié)核分枝桿菌檢出陽(yáng)性率比較

抗酸染色法、CapitalBio及Qiagen RTFQ-PCR試劑盒結(jié)核分支桿菌檢出陽(yáng)性率分別為53.33%（64/120），57.50%（69/120），80.83%（97/120）；Qiagen RTFQ-PCR試劑盒結(jié)核分支桿菌檢出陽(yáng)性率顯著高于抗酸染色法、CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒（χ2=8.17，P＜0.05）；同時(shí)抗酸染色法和CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒結(jié)核分支桿菌檢出陽(yáng)性率比較差異無(wú)顯著性（χ2=2.01，P ＞0.05）；其中2例NTM感染淋巴結(jié)陰性對(duì)照組織標(biāo)本Qiagen RTFQ-PCR試劑盒檢測(cè)陰性，而抗酸染色法和Capital BioRTFQPCR試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性。

2.2 兩種方法檢測(cè)不一致樣本分析

全部120例組織標(biāo)本中7例在接受規(guī)范抗結(jié)核治療后送檢，抗酸染色法和PCR法均未檢出；抗酸染色法陽(yáng)性標(biāo)本為64例，PCR試劑盒檢測(cè)亦均為陽(yáng)性；其中7例抗酸染色判讀為陰性但PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性病例再次閱片后可見(jiàn)少量散在抗酸桿菌，重判陽(yáng)性。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法是公認(rèn)結(jié)核病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、培養(yǎng)陽(yáng)性率低缺陷導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限[6]；目前臨床檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌常規(guī)采用抗酸染色，但亦存在總體敏感性、特異性較低，漏診率高等問(wèn)題[7]。已有臨床報(bào)道顯示[8]，送檢樣品含桿菌量需在10 000個(gè)/mL以上抗酸染色方可呈陽(yáng)性，且極易受觀察者主觀因素影響。

近年來(lái)隨著新型檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展成熟，以PCR法為代表分子生物學(xué)手段開(kāi)始在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用；同時(shí)該方案極大提高結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)時(shí)效性，并為后續(xù)臨床防治工作提供更為有效證據(jù)[9-10]。PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌較傳統(tǒng)方法更為客觀，具有準(zhǔn)確性高，可重復(fù)及耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)；同時(shí)其還能夠區(qū)分分枝桿菌類型，即確認(rèn)是否屬于結(jié)核分枝桿菌感染；此外對(duì)于部分陳舊性結(jié)核病例，凝固性壞死及纖維化組織中抗酸染色多為陰性，而采用PCR法可能夠提高此部分患者檢測(cè)陽(yáng)性率[11]。

本次研究結(jié)果中，Qiagen RTFQ-PCR試劑盒結(jié)核分支桿菌檢出陽(yáng)性率顯著高于抗酸染色法、CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒（χ2=8.17，P＜0.05），筆者認(rèn)為這可能與試劑盒引物和探針設(shè)計(jì)因素有關(guān)；而CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒檢測(cè)靈敏度則與常規(guī)抗酸染色接近，與以往報(bào)道結(jié)果不符[12]；需要注意到本次研究中，7例抗酸染色判讀為陰性但Qiagen RTFQ-PCR試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性病例再次閱片后可見(jiàn)少量散在抗酸桿菌，重新判讀為陽(yáng)性，這可能是導(dǎo)致抗酸染色檢出陽(yáng)性率較以往報(bào)道更高主要原因。本次研究7例對(duì)照組標(biāo)本Qiagen RTFQ-PCR試劑盒檢測(cè)均為陰性，但其中非結(jié)核分枝桿菌感染2例，抗酸染色法和CapitalBio RTFQPCR試劑盒檢測(cè)均為炎性。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為晶CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分支桿菌特異性序列分別進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)，并標(biāo)記不同熒光發(fā)光基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)在同一體系檢測(cè)對(duì)兩類分枝桿菌進(jìn)行區(qū)分[12]；但Qiagen RTFQ-PCR試劑盒僅能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，而抗酸染色則可檢出全部抗酸分枝桿菌，無(wú)法實(shí)現(xiàn)兩類分枝桿菌準(zhǔn)確區(qū)分；故在這一方面CapitalBio RTFQ-PCR試劑盒均有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，PCR法用于結(jié)核病結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)敏感性優(yōu)于抗酸染色法，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。