小球藻不同接種密度對銅綠微囊藻生長抑制的研究

朱為菊

摘 要：以同周期單獨培養的微囊藻生長密度為對照，將小球藻在低密度、中密度和高密度條件下，分別與低密度的銅綠微囊藻共同培養，探究對其生長抑制作用。結果表明：（1）小球藻的初始密度不同，對其的生長具有顯著影響（p<0.01，F=5.75），隨著初始接種密度的增加，最大生物量、生長速率均存在差異。當2種微囊藻的初始接種密度為4.5×105個/mL單獨培養條件下，銅綠微囊藻的生長速率高于小球藻的，但是其藻類最大現存量卻低于小球藻的。（2）在共培養條件下，當銅綠微囊藻密度不變，隨著小球藻接種密度的提高，對微囊藻生長的影響效果愈加明顯，尤其是當小球藻密度提高至9×105個/mL以上時。

關鍵詞：銅綠微囊藻;接種密度;競爭抑制參數;藻類水華防治

中圖分類號 X52文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）24-0137-04

Abstract：In this paper，comparing with the concentration of microalgae individually cultivated in the same period，we investigated the growth of different initial cell density of Chlorella sp.，as well as the concentrations of them affecting the growth of Microcystis aeruginosa by a mixed culture method. The results showed that the growth of the initial cell density of Chlorella sp. had a significant difference（p<0.01，F=5.75），and the differences of maximum biomass and growth rate were obvious with the promotion of the initial cell density of Chlorella. When the initial cell density of Chlorella sp. and M. aeruginosa were 4.5×105cells/ml in single cultivation period，the growth rate of M. aeruginosa is higher than of Chlorella.，but the maximum cell density of M. aeruginosa is lower than of Chlorella. The Chlorella can inhibit the growth the M. aeruginosa，and the inhibition was more obvious with the promotion of the initial cell density of Chlorella，especially the cell density reached the 9×105 cells/mL.

Key words：Microcystis aeruginosa;Initial cell density;Competitive inhibition parameters;Control of the algal bloom

藻類水華是全球性的水生態災害，由于微囊藻水華出現頻率較高且危害嚴重，日益引起了國內外學者的廣泛關注[1-2]，開展了大量的野外跟蹤調查和室內模擬研究以揭示藍藻水華的暴發機制，并采取了相應的防控措施[3]。研究表明，微囊藻獨特的生物學特性（具有偽空胞、對磷吸收利用能力強等）[4-6]，使其在高溫、低光的環境條件下具有較強的競爭優勢[7]。在綠藻與銅綠微囊藻共培養的體系中，隨著溫度的升高，混合培養體系中微囊藻的優勢地位逐漸明顯[8]。在硅藻與銅綠微囊藻的共培養體系中，當Si∶P<100時，微囊藻占優勢[9]。在銅綠微囊藻與小球藻的共培養體系中，高營養水平下的銅綠微囊藻在競爭中占優勢，低營養水平時小球藻具有競爭優勢;而在同一營養水平條件下，氮是銅綠微囊藻競爭優勢的先決因子，而小球藻是磷[10]。對于藻華的防治，多數研究集中在調控水體的環境條抑制水華的發生，而關于藻類不同起始密度對水華藍藻生長抑制的影響研究則相對較少[11]。為此，本研究以銅綠微囊藻和從海南省當地水體中分離的1株小球藻為實驗材料，探究小球藻不同接種起始密度對銅綠微囊藻生長的抑制作用，旨在闡明小球藻與銅綠微囊藻之間的競爭關系，同時為藻類水華生物防治提供一定的基礎資料和科學依據。

1 材料與方法

1.1 藻種來源 實驗所用的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-315;小球藻取自海南省內淡水水體，經分離純化;2個藻株均用BG11培養基經實驗室內擴大培養用于實驗[12]。

1.2 實驗設計 本實驗設置3個小球藻密度梯度，分別為低密度組（4.5×105個/mL）、中密度組（9×105個/mL）、高密度組（18×105個/mL），并與濃度為4.5×105個/mL銅綠微囊藻進行共同培養實驗。以單獨培養藻株作為對照實驗。每組設3次重復。

1.3 培養方法 培養液采用BG11培養基，取指數生長期的藻液接種至滅菌的含有50mL培養液的100mL三角錐形瓶中，置于恒溫光照搖床中震蕩培養，培養條件為：25℃、230r/min、24h全光照、光照強度3000lx。

1.4 數據統計

1.4.1 細胞密度 自接種次日起為第1天，在上午10：00每隔48h在無菌條件下取樣，利用血球計數板進行細胞計數。每個樣品計數3次，取其平均值。

1.4.2 比生長速率 根據藻液細胞密度計算比生長速率[13]。計算公式如下：

式中：μn為第n天的比生長速率;Nn為第n天的細胞密度（cells·mL-1）;Nn-1為第n-1天的細胞密度（cells·mL-1）;tn為對應于Nn的培養天數;tn-1為對應于Nn-1的培養天數。同時，將藻類從試驗開始至生物量達最大現存量這一時間段內的比生長速率的平均值定義為藻類的平均比生長速率（μ），用于比較藻類生長速率的大小。

1.4.3 抑制率 對藻類共同培養的競爭結果采用抑制率（促進率）表示[14-15]。計算公式如下：

抑制率（%）=（共同培養的最大現存量一同期單獨培養的現存量）/同期單獨培養的現存量×100 （2）

正值表示促進作用，負值表示抑制作用。

2 結果與分析

2.1 低密度條件下小球藻和微囊藻的生長情況 在單獨培養的條件下，微囊藻和小球藻在接種第3天均進入快速生長時期。微囊藻在培養第9天達到最高值為1.43×107個/mL，小球藻第13天密度達到最高值為2.51×107個/mL（圖1）。當2種藻類共同培養時，小球藻在接種后第3天密度達到3.95×106個/mL，為單獨培養時的16%，第3天后小球藻的生長被微囊藻所抑制（圖2）。而微囊藻在接種后第17天密度達到1.88×107個/mL，與單獨培養時密度值接近（圖2）。在共同培養條件下，微囊藻的平均比增長速率低于單獨培養條件下，而小球藻的平均比增長速率高于單獨培養條件下的（表1）。

2.2 中密度條件下小球藻和微囊藻的生長情況 當小球藻接種密度為9×105個/mL時，其生長曲線呈現波折式，在接種第9天達到最大現存量，為1.35×107個/mL（圖3）。當小球藻接種密度為9×105個/mL與微囊藻接種密度為4.5×105個/mL共同培養時，小球藻能抑制微囊藻生長，抑制時間為7d（圖4）。小球藻密度在培養第7天達到最高為5.73×106個/mL，為單獨培養時密度最高值的42%，微囊藻在培養第11天，密度達到最高為8.38×106個/mL，為單獨培養時密度最高值的58%。在共同培養條件下，微囊藻和小球藻的平均比增長速率均低于單獨培養條件下的（表1）。

2.3 高密度條件下小球藻和微囊藻的生長情況 當小球藻接種密度為18×105個/mL時，其生長曲線呈現波折式，在接種第7天達到最大現存量，為1.73×107個/mL（圖5）。當小球藻接種密度為18×105個/mL與微囊藻接種密度為4.5×105個/mL共同培養時，小球藻能抑制微囊藻的生長，抑制時間為14d（圖4）。小球藻的密度在培養第9天達到最高為9.03×106個/mL，為單獨培養時密度最高值的52%，微囊藻在培養第17天，密度達到最高為7.77×106個/mL，為單獨培養時密度最高值的54%。在共同培養條件下，微囊藻和小球藻的平均比增長速率均低于單獨培養條件下的（表1）。

2.4 小球藻和微囊藻共培養條件下的相互作用 從表2可以看出，在低密度共同培養條件下，小球藻和微囊藻之間表現為相互促進的作用，其中小球藻對微囊藻的促進作用更為明顯。在中密度共同培養條件下，小球藻對微囊藻的生長有抑制作用，但是抑制較弱;微囊藻對小球藻的生長有促進作用。在高密度條件下，小球藻和微囊藻之間表現為相互抑制的作用，其中小球藻對微囊藻的抑制作用更為明顯。

3 討論

3.1 銅綠微囊藻和小球藻的生長 從低密度條件下2種藻類的單獨培養來看，銅綠微囊藻的生長速率高于小球藻的，但是其藻類最大現存量卻低于小球藻的。這主要是由于銅綠微囊藻在培養第9天細胞密度達到最高，而小球藻在培養第11天細胞密度達到最高，導致生長速率低于微囊藻的。張曉玥[16]對銅綠微囊藻和小球藻的研究發現，銅綠微囊藻的生長速率高于小球藻的，細胞密度最大值為1.41×107個/mL，與本研究銅綠微囊藻的最大現存量相當，小球藻的細胞密度最大值為8.12×106個/mL，比本研究小球藻的最大現存量低，這說明小球藻具有較長的生長期。小球藻的初始密度不同對其生長有顯著影響（p<0.01，F=5.75）。隨著初始接種密度的增加，最大生物量、生長速率都存在差異。蔡恒江[14]研究發現，隨著接種密度的增加，赤潮異彎藻、中肋骨條藻、塔瑪亞歷山大藻進入指數生長期和靜止期的時間都相應的提前，且3種藻細胞最大細胞密度均相應地降低。張坤等[17]研究表明，當微囊藻的初始接種密度不同時，銅綠微囊藻的最大生物量、生長速率以及拐點時間都存在差異。這說明，在微藻生長過程中，微藻起始密度對其生物量和種群密度有著很大的影響，進而影響其對資源的競爭和生物抑制作用的發揮。

3.2 小球藻與銅綠微囊藻的種間競爭 種間競爭主要表現在對營養鹽、光照等資源的競爭及分泌克生物質而抑制對方[18-19]。當小球藻與銅綠微囊藻在起始密度相同的共培養條件下，銅綠微囊藻以其較小的比表面積[4]，能較快的獲取生長所需的營養鹽、光照，具有較強的競爭優勢。銅綠微囊藻是水華藍藻的常見種類之一，由于其對外界磷的吸收、利用能力強，在水體中容易獲得優勢地位[5]。錢善勤[20]研究發現，銅綠微囊藻對可溶性有機磷的利用能力強于蛋白核小球藻的，這可能是導致其富營養化水體中形成優勢種的原因之一。陳德輝等[21]研究表明，微囊藻對柵藻的抑制能力是柵藻對微囊藻抑制能力的7倍，并以此作為微囊藻可能爆發成為“水華”的理由之一。也有研究認為，微囊藻能夠分泌毒素對其他藻類產生他感作用而抑制對方的生長。許秋瑾等[22]研究表明，微囊藻毒素對柵藻的生長具有顯著的抑制作用，而且微囊藻在與柵藻混合培養時比純培養時能產生更多的毒素。Fogg等[23]研究發現，藻類在生長發育過程中會不斷向周圍環境釋放多種物質，如碳水化合物、酶、脂類、毒素以及抑制和促進因子等來影響水體中其他藻類的生長發育。譚嘯等研究表明，在四尾柵藻和銅綠微囊藻共培養的體系中，當溫度從22℃升高到30℃，優勢種從四尾柵藻轉變為銅綠微囊藻[8]。藍藻和綠藻吸收水體中CO2的能力是不同的[24]。Shapiro[25]等綜合前人及本人的實驗結果，提出了藍藻形成優勢的高pH/低CO2理論。

隨著小球藻起始密度的增加對微囊藻的生長影響效果愈明顯，可以通過提高小球藻的密度至9×105個/mL以上，來控制密度為4.5×105個/mL微囊藻的生長。蔡恒江等[14]研究發現，隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增高，該種類對中肋骨條藻的生長的抑制作用也更加明顯。陳家長等[26]研究發現，可以通過條件水體pH值以及普通小球藻的濃度來控制魚腥藻的生長。Piazzi等[27]研究了2種微藻種內和種間競爭，發現在細胞密度較低情況下，2種微藻的競爭現象不明顯，但隨著培養時間的增加，細胞密度變大，微藻間的抑制作用變得明顯，培養后期微藻間出現競爭，可能是因為空間和營養資源的缺乏。本研究發現，可能由于水體中資源和空間受到限制，導致2種微藻的最大生物量相對于單培養試驗數值降低。藍藻水華的暴發通常是單一物種占優勢[2]，因此，為了減少水華的暴發幾率，可以通過提高共生有益藻類的競爭優勢，來降低水華藻類的生物量以及抑制其在生長的各個階段的競爭優勢。

4 結論

（1）小球藻初始密度的不同，對其生長具有顯著的影響（p<0.01，F=5.75）。隨著初始接種密度的增加，最大生物量、生長速率均存在一定的差異。

（2）在2種藻類共同培養的條件下，隨著小球藻起始密度的增加，對微囊藻生長的影響效果愈加明顯。當小球藻的密度提高至9×105個/mL以上，可以控制密度為4.5×105個/mL微囊藻的生長。

（3）通過提高共生有益藻類的競爭優勢，可以降低水華藻類的生物量以及抑制其在生長的各個階段的競爭優勢，實現藻類水華的生物防治。

參考文獻

[1]Duan H，Ma R，Xu X，et al.Two-decade reconstruction of algal blooms in China′s LakeTaihu[J].Environmental Science & Technology，2009，43（10）：3522-3528.

[2]Paerl H W.Mitigating harmful cyanobacterial blooms in a human-and climatically-impacted world[J].Life，2014，4（4）：988-1012.

[3]Paerl H W，Otten T G.Harmful cyanobacterial blooms：causes，consequences，and controls[J].Microbial Ecology，2013，65（4）：995-1010.

[4]胡鴻鈞，魏印心.中國淡水藻類：系統、分類及生態[M].北京：科學出版社，2006.

[5]史小麗，史小麗.銅綠微囊藻的生長及磷代謝的研究[D].南京：南京大學，2003.

[6]岳濤，張德祿，胡春香.太湖3種優勢微囊藻對不同形態磷的吸收利用[J].湖泊科學，2014，26（3）：379-384.

[7]劉世明，朱雪竹，張民.銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）生長及光合活性對溫度和光照交互作用的響應[J].湖泊科學，2014，26（5）：773-779.

[8]譚嘯，孔繁翔，曹煥生，等.利用流式細胞儀研究溫度對2種藻競爭的影響[J].湖泊科學，2006，18（4）：419-424.

[9]Holm N P，Armstrong D E.Role of Nutrient Limitation and Competition in Controlling thePopulations of Asterionella formosa and Microcystis aeruginosa in Semicontinuous Culture[J].Limnology & Oceanography，1981，26（4）：622-634.

[10]張晶晶，周進，張懷瑾，等.不同營養條件下銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和小球藻（Chlorella vulgaris）的生長競爭行為[J].海洋與湖沼，2016，47（5）：1013-1023.

[11]謝志浩，俞泓伶，裘輝.不同起始密度對等鞭金藻和三角褐指藻種間生長的影響[J].寧波大學學報（理工版），2011，24（4）：1-4.

[12]Rippka R，Deruelles J，Waterbury J，et al.Generic assignments，strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria[J].Journal of General Microbiology，1979，111：1-61.

[13]Chu Z，Jin X，Iwami N，et al.The effect of temperature on

growth characteristics and competitions of Microcystis aeruginosa and Oscillatoria mougeotii in a shallow，eutrophic lake simulator system[J].Hydrobiologia，2007，581（1）：217-223.

[14]蔡恒江，唐學璽，張培玉，等.不同起始密度對3種赤潮微藻種間競爭的影響[J].生態學報，2005，25（6）：1331-1336.

[15]朱偉，萬蕾，趙聯芳.不同溫度和營養鹽質量濃度條件下藻類的種間競爭規律[J].生態環境學報，2008，17（1）：6-11.

[16]張曉玥，王艷，張玉柱，等.銅綠微囊藻和小球藻室內競爭實驗研究[J].水生態學雜志，2009（6）：138-140.

[17]張坤，戴習林.5種微藻及其密度對銅綠微囊藻生長的影響[J].廣東農業科學，2012，39（10）：166-169.

[18]鄭朔方，楊蘇文，金相燦.銅綠微囊藻生長的營養動力學.環境科學，2005，26（2）：152-156.

[19]鄭忠明，白培峰，陸開宏，等.銅綠微囊藻和四尾柵藻在不同溫度下的生長特性及競爭參數計算[J].水生生物學報，2008，32（5）：720-727.

[20]錢善勤，孔繁翔，張民，等.銅綠微囊藻和蛋白核小球藻對不同形態有機磷的利用及其生長[J].湖泊科學，2010，22（3）：411-415.

[21]陳德輝，劉永定，袁峻峰，等.微囊藻和柵藻共培養實驗及其競爭參數的計算.生態學報，1999，19（6）：908-913.

[22]許秋瑾，高光，陳偉民.從種群競爭的角度初步研究微囊藻的產毒機理.生物學雜志，2004，21（1）.

[23]Fogg G E.Extracellular products of algae in freshwater[J].Ergebnisse Der Limnologie，1971，5：1-25.

[24]馬祖友，儲昭升，胡小貞，等.不同磷質量濃度體系中pH變化對銅綠微囊藻和四尾柵藻競爭的影響[J].環境科學研究，2005，18（5）：30-33.

[25]Shapiro J.Current beliefs regarding dominance by blue-greens ：the case for the importance of CO2 and pH[J].Verh Int Verein Limnol，1990，24：38-54.

[26]陳家長，王菁，裘麗萍，等.pH對魚腥藻和普通小球藻生長競爭的影響[J].生態環境學報，2014，42（2）：289-294.

[27]Muller-feuga A.The role of microalgae in aquaculture：situation and trends[J].Journal of Applied Phycology，2000，12（3/5）：527-534.

（責編：張宏民）