肝癌中骨形態發生蛋白7表達及其與生存相關性分析*

李鍇，宋燕州，李偉

（江蘇省連云港市第一人民醫院 普通外科，江蘇 連云港 222000）

世界范圍內的肝細胞肝癌發生率逐年增加，已經成為腫瘤死亡的第3位[1]。大多數肝癌患者的預后非常差，每年新診斷患者數接近每年死亡的數量[2]。這一可怕局面源于缺乏早期診斷、大多數可發展為肝癌的肝硬化惡化以及肝癌化療的高耐藥性[3]。轉化生長因子（transforming growth factor, TGF）在肝纖維化及肝硬化中起到重要作用，作為超家族成員中最大的一族，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）具有抗纖維化作用，在細胞的增殖、分化及凋亡中扮演著重要的角色。既往已經在體外經過分子、細胞水平驗證BMP-7在肝癌相關細胞中發揮促生成作用[4-5]，但BMP-7在肝癌組織中的表達及其與患者預后的關系尚未見諸報導，本研究旨在揭示BMP-7在不同肝臟組織中的表達，并探究其與肝癌患者預后的關系，為進一步研究肝癌發生、發展的分子生物學機制打下基礎。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

兔抗人多克隆BMP-7抗體（美國Proteintech公司），DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）、即用型免疫組織化學EliVision plus試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SYBR PCR試劑盒（日本TaKaRa生物工程公司）。UV分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗資料 于連云港市第一人民醫院生物標本庫中取得2010年1月—2013年12月間手術切除的肝癌組織85例及20例癌旁組織標本（距腫瘤邊緣1 cm），以肝血管瘤及肝臟外傷患者14例手術標本作為良性對照。上述組織術后均經病理檢測證實其診斷。

1.2.2 免疫組織化學檢測 按說明書基本操作流程操作，BMP-7一抗加入PBS稀釋濃度為1∶200，BMP-7二抗用PBS稀釋為1∶6。

1.2.3 肝臟組織總RNA的提取、RNA逆轉錄、實時逆轉錄聚合酶鏈反應 依據說明書逐步提取肝臟組織總RNA，通過UV分光光度計檢測在260和280 nm波長處的吸光度后置入-80℃冰箱冷凍保存。根據逆轉錄試劑盒說明書，將1 μg RNA逆轉錄為cDNA（20 μl逆轉錄反應體系）。實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR），以β-actin作為內參，25 μl反應體系（包括逆轉錄產物1 μl，2×PCR反應mix 12.5 μl，正向引物 1 μl，反向引物 1 μl，dH2O 9.5 μl），反應條件 ：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，共持續35個循環。

1.3 肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7免疫組織化學檢測

對應生物標本庫中所取患者信息，選取相應肝癌組織石蠟標本、癌旁組織石蠟標本及非癌肝臟組織石蠟標本，上述組織術后均經病理檢測證實其診斷。對肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7進行免疫組織化學檢測，石蠟切片脫蠟、水化、微波抗原修復，3%過氧化氫除去內源性過氧化物酶，BMP-7免疫組織化學檢測按試劑盒說明書進行，DAB染色，蘇木素復染，梯度乙醇一二甲苯脫水，封片。顯微鏡下觀察，胞核內出現棕黃色顆粒者為免疫組織化學染色BMP-7陽性細胞。

1.4 結果判定標準

按細胞胞核內出現棕黃色顆粒為陽性信號，每張切片光學顯微鏡下查看5個隨機的視野（400倍），再用隨機的方法選擇200個細胞，計算BMP-7表現陽性的百分比，取均值；BMP-7陽性細胞≥10%判定為組織BMP-7陽性。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計數資料采用例表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，應用Kaplan-Meier生存法統計繪制BMP-7陽性表達與陰性表達患者生存曲線，Logrank檢驗比較BMP-7表達對肝癌患者遠期生存率的影響，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達

肝癌組織中BMP-7陽性率為77.6%，癌旁組織中BMP-7陽性率為55.0%，非癌肝臟組織BMP-7陽性率為35.7%，BMP-7在3種組織中表達的陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=12.035，P=0.002）（見表1）。肝癌組織中BMP-7表達高于癌旁組織及非癌肝臟組織，且陽性率從非癌肝臟組織、癌旁組織到肝癌組織呈現遞減現象。

肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7的表達見圖1。肝癌組織陽性表達細胞數為（173.6±20.4）個，癌旁組織（65.4±36.9），非癌肝臟組織（29.4±7.8）個，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=365.016，P=0.000），各組BMP-7表達的水平有差異；與肝癌組織比較，癌旁組織及非癌肝臟組織中可見BMP-7陽性表達細胞數較少，進一步兩兩比較顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中BMP-7陽性表達細胞數增多（q=26.714，P=0.042）；與非癌肝臟組織比較，肝癌組織中BMP-7陽性表達細胞數增多（q=30.677，P=0.021）。BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達分別為（2.213±0.210）、（1.126±0.182）及（0.786±0.319），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=392.607，P=0.000），各組BMP-7的表達水平有差異；進一步兩兩比較顯示，肝癌組織中BMP-7相對表達量較癌旁組織增高（q=3.361，P=0.019）；肝癌組織中BMP-7相對表達量較非癌肝臟組織增高（q=2.805，P=0.032）（見圖 2）。

表1 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織中的表達情況 例（%）

圖1 BMP-7在不同組織中的表達 （免疫組織化學法×400）

2.2 BMP-7與肝癌患者臨床病理特征的關系

與BMP-7陰性組織比較，BMP-7陽性組織的腫瘤直徑、分化程度及2年生存率的比例降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；組織分型上，低、未分化組織BMP-7陽性表達較中、高分化組織高，差異有統計學意義（P＜0.05）。性別、年齡及術后腫瘤是否復發的BMP-7表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達

2.3 BMP-7在肝癌的表達與患者預后生存之間的關系

與BMP-7陰性表達患者比較，BMP-7陽性表達患者的總生存率降低（χ2=8.132，P=0.004）。見圖3。

表2 BMP-7表達與肝癌臨床病理特征之間的關系

續表2

圖3 BMP-7陽性及陰性表達肝癌患者術后生存曲線圖

3 討論

作為TGF家族之一，BMP-7從人類血小板中第一次分離出來，同時發現它可以減少創傷的愈合時間[6]，繼而在乳腺癌、胃癌、腎癌、結直腸癌等許多腫瘤組織中均發現高表達的BMP-7[7-8]。許多相關研究指出，TGF-β作為轉化生長因子超家族可以通過相關信號通路，在調控細胞生長、影響細胞發育、控制細胞分化等過程中發揮作用，BMP-7可以使前炎癥細胞因子水平下降；也可以促進基質金屬蛋白酶的生成，以上等研究進一步表明BMP-7可以使細胞的纖維化過程發生逆轉。

通過下調前炎癥因子及誘導基質金屬蛋白酶等進而逆轉組織細胞的纖維化[9]。BMP-7通過拮抗TGF-β/Smads信號通路在肝臟組織細胞的慢性纖維化過程中發揮重要的調節作用[10-11]。TGF-β可減弱上皮細胞的分裂增殖，以上也可以發生在免疫細胞中，抑制增殖的過程可以促進上皮間質轉化的發生，進而促進肝臟細胞的可塑性變化、誘導產生肝癌細胞[12]。BMP-7可以阻抑TGF-β，BMP-7在細胞中表達水平的異常可能抑制肝癌細胞的分裂增殖，同時減弱肝癌細胞的相關功能。

本研究結果表明，BMP-7與肝癌的發生、發展關系密切，其在肝癌組織中的表達遠高于癌旁組織、非癌肝臟組織，陽性表達BMP-7的肝癌患者其表達水平與腫瘤大小、分化程度密切相關，且其預后較陰性表達者差，需進一步深入的機制研究。抑制BMP-7的表達或可改善肝癌患者的術后生存狀況，檢測BMP-7的表達或可成為肝癌患者預后的預測指標之一。