白藜蘆醇對小鼠體內Lewis肺癌細胞生長的抑制作用及免疫調節機制研究*

隋萍 孫欣宇 張琛 王騫 孫婧瑜 翟浩帆 王琪

白藜蘆醇（resveratrol，Res）為非黃酮類的多酚化合物，廣泛分布于葡萄科、百合科、豆科、寥科等70多種植物中[1-2]。目前，Res抗腫瘤作用已經在多種體外細胞實驗及動物模型上得到證明，但Res對于不同的癌細胞，其抗癌作用效果、作用途徑和劑量不同[3-4]；其在體內與體外實驗的抑瘤效果和機制也不盡相同[5]，故而Res的抗癌作用還需進一步的深入研究。本實驗以Lewis肺癌荷瘤小鼠為研究對象，觀察在小鼠體內Res對Lewis腫瘤細胞生長的抑制作用，并研究Res對荷瘤小鼠免疫功能的影響，以探討Res抑制腫瘤細胞生長的免疫機制，為大力開發Res，研制抗癌新藥提供實驗依據[6]。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：40只昆明小鼠，體重（20.0±2.0）g，雌雄各半，由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供。（2）藥物及試劑：Res（上海源葉，批號20160218，純度＞98%），酶聯免疫試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；四甲基偶氮唑鹽試劑盒（MTT，美國Sigma公司）；環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）。（3）瘤株：小鼠非小細胞肺癌細胞Lewis細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 造模、動物分組及給藥 取對數生長期的Lewis細胞，胰酶消化處理，制備成1×107/mL細胞懸液，在30只小鼠前肢腋下皮下接種，每只接種0.2 mL。造模后將荷瘤小鼠隨機分為模型組、Res組、環磷酰胺組，各10只，另取未接種荷瘤小鼠10只為正常對照。正常對照組：0.2 mL/10 g生理鹽水灌胃；模型組：0.2 mL/10 g生理鹽水灌胃；環磷酰胺組：腹腔注射環磷酰胺20 mg/kg；Res組：Res以二甲基亞砜（DMSO）助溶（DMSO終濃度不高于0.5%），再以生理鹽水溶解，200 mg/kg灌胃。接種后次日給藥，各組每天給藥一次，連續10 d。

1.3 觀察指標及判定標準

1.3.1 觀察各組小鼠生長情況 觀察各組小鼠生長的一般情況，監測小鼠的重量，以分析Res對荷Lewis肺癌細胞小鼠及腫瘤生長的影響。

1.3.2 瘤重 停藥后次日，脫椎處死小鼠，鈍性剝離腫瘤組織，剔除周圍結締組織，稱瘤重。

1.3.3 觀察小鼠脾淋巴細胞轉化率（MTT比色法） 開腹取脾臟組織，剪碎、研磨，200目篩過濾，制備單細胞懸液，1 500 r/min 離心 10 min，棄上清，加入 10 mL NH4Cl 37℃水浴 10 min 后，用 PBS 溶液洗滌兩次，將細胞懸浮于2 mL培養液中使濃度為2×106/mL。將每只小鼠的細胞懸液分6孔接種于96孔培養板中，其中3孔加培養液100 μL PHA液（實驗孔），另3孔加培養液100 μL PHA液（對照孔）37 ℃，5% CO2培養箱內培養 48 h；每孔加入20 μL MTT 溶液（5 g/mL），繼續培養 4 h 后去上清，每孔加入 DMSO 200 μL。振蕩 10 min 后通過酶標儀測定波長490 nm處細胞吸光度（A）值，以刺激指數（SI）值反映脾淋巴細胞轉化率，刺激指數越高，脾淋巴細胞轉化率越高。SI=PHA刺激孔A平均值/細胞對照孔A平均值。以分析Res對荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響。

1.3.4 觀察血清細胞因子水平 停藥后次日，眼眶取血并脫臼處死，血樣于 3 500 r/min離心 15 min 后分離上清液，用于細胞因子的檢測。采用雙抗體夾心法[7]，按照試劑盒說明書步驟檢測各組IL-2、IL-4的含量，以分析Res對荷瘤小鼠血清中細胞因子水平的影響。

1.4 統計學處理 使用SPSS 11.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x-±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠生長情況分析 接種Lewis肺癌細胞前，各組小鼠生長狀態良好，小鼠毛發濃密，油光發亮，活潑好動；接種癌細胞后，隨著腫瘤的逐漸增大，小鼠行動緩慢，精神萎靡，飲食較差，毛發粗糙，無光澤，右側腋窩皮下局部均形成約0.4 cm×0.4 cm的腫瘤，質硬、活動、與胸壁不粘連；經過治療，與模型對照組比較，Res組小鼠皮毛松散、飲食差等狀況均較模型對照組、環磷酰胺組減輕。

2.2 模型組、Res組、環磷酰胺組瘤重比較 Res組、環磷酰胺組瘤重分別為（0.90±0.05）、（0.56±0.07）g，均低于模型組的（1.47±0.16）g，比較差異均有統計學意義（t=4.558、3.421，P=0.000、0.002）。

2.3 各組小鼠SI值比較 正常對照組、模型組、Res組、環磷酰胺組SI值分別為（1.26±0.06）、（1.16±0.07）、（1.24±0.04）、（1.18±0.07），其中模型組和環磷酰胺組SI值均低于正常對照組（t=3.430、2.744，P=0.003、0.013）；模型組和環磷酰胺組的SI值均低于Res組（t=3.138、2.353，P=0.005、0.030）；但正常對照組和Res組SI值比較差異無統計學意義（t=0.877，P=0.391）。

2.4 各組小鼠血清細胞因子水平比較 模型組、環磷酰胺組IL-2水平均低于正常對照組、Res組，IL-4水平均高于正常對照組、Res組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；但Res組與正常對照組IL-2、IL-4水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組小鼠血清細胞因子水平比較[pg/mL，（x-±s）]

3 討論

隨著工業化和城市化的發展，肺癌嚴重威脅著人類的健康和生命，已成為當今世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[8]。導致這種結果的主要原因是肺癌的遠處轉移和治療后的局部復發[9]，因此尋找一種既可直接殺傷腫瘤細胞，又能夠提高患者機體免疫功能、消滅循環系統微轉移和遠處轉移的抗癌新藥具有重要意義[10-11]。

現已發現Res對消化、血液、呼吸、生殖等多個系統來源的腫瘤細胞的生長有一定的抑制和細胞毒作用[12-13]，但Res的抗腫瘤研究主要在體外進行，而藥物必須通過體內代謝活化或機體反應才能發揮作用，體外的藥效結果在體內不一定都能相對應，并且Res對不同腫瘤細胞株的抑瘤作用及機制不同，有關Res對Lewis肺癌小鼠體內的免疫調節作用的研究報道較少[14-15]。本實驗通過右腋窩皮下注射接種Lewis肺癌細胞懸液的方法制備荷肺癌小鼠模型，研究結果顯示，Res組瘤重低于模型組（P＜0.05）。模型組和環磷酰胺組SI值均低于正常對照組、Res組（P＜0.05），但正常對照組和Res組SI值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。提示Res具有抑制Lewis肺癌細胞生長的作用，并具有一定的免疫調節作用。

機體的抗腫瘤作用是以Th1介導的細胞免疫為主，但大多數腫瘤患者體內常發生Th1向Th2漂移，表現為Th2型細胞因子占優勢，機體的抗腫瘤免疫將受到嚴重干擾，腫瘤細胞有可能發生免疫逃逸[16-17]。因此，糾正荷瘤機體免疫功能紊亂狀態，誘導Th1細胞的優勢極化，在腫瘤特異性免疫治療中具有重要意義[18]。IL-2為Th1型細胞因子，IL-4為Th1型細胞因子[19]。本研究結果顯示，模型組、環磷酰胺組IL-2水平均低于正常對照組、Res組，IL-4水平均高于正常對照組、Res組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；但Res組與正常對照組IL-2、IL-4水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明在荷瘤機體內，免疫功能處于紊亂狀態，發生Th1/Th2漂移，Th2細胞相對處于優勢地位，抑制了抗腫瘤特異性免疫應答Th1細胞的優勢狀態。Res能有效調節機體免疫功能，糾正Th1/Th2漂移，可以促進Th1類細胞因子的表達，使荷瘤小鼠分泌的細胞因子由Th2型向Th1型轉變。

綜上所述，Res作為一種重要的中藥單體，具有抑制小鼠體內Lewis肺癌細胞生長的作用，其機制可能與調節體內細胞因子水平，糾正荷瘤機體的Th1/Th2漂移現象有關，但具體的機制還需進一步深入研究。