微嗜酸寡養單胞菌的分離培養及其對顏料紅23的降解

孫璐璐，趙曉祥，白 恒，程 晨

(東華大學 環境科學與工程學院， 上海 201620)

染料是紡織工業的基礎原料，其在使用過程中約有10%會通過印染廢水進入環境中，造成水環境污染[1]。染料污染水體，不僅會改變水體色度，影響水體的透光度和溶解度，威脅水體生物，而且染料中含有的環狀芳香族化合物會造成生態風險，危害人體健康[2]。由于偶氮染料合成工藝較成熟、成本較低、產品光澤較好且色澤牢固，其在印染工業中被廣泛使用且用量最大，占全部染料的50%以上[3]。偶氮染料及其降解產物通常含有芳香胺類化合物，具有致畸、致癌和致突變的作用[4]，因此，偶氮染料的降解脫色受到了國內外學者的廣泛關注。

目前，對偶氮染料的脫色處理方式集中在物化方法[5]，例如離子交換法、光氧化法、反滲透膜過濾法、電凝法、深層注射法、吸附法、絮凝法、臭氧氧化法、焚燒法和有機溶劑提取法等，但這些方法存在成本高、能耗大，可能造成二次污染的問題[6]。生物法為生物降解和生物吸附的共同作用方法。生物降解主要通過微生物分泌的胞外氧化酶進行偶氮染料的脫色處理[7]；而生物吸附主要通過菌絲體的自身結構與染料等大分子物質相結合進行脫色[8]。目前，已報道的高效脫色菌株包括Gracilibacillussp.GTY[9]、Halomonassp.GTW[10]、Aeromonassp.DH-6[11]等。生物法高效穩定，具有環境友好型的經濟效益，被廣泛地應用于實際工程。

本文篩選出對偶氮染料具有高效脫色作用的微嗜酸寡養單胞菌，該菌株已有關于解毒效能方面的研究[12]，但針對偶氮染料降解的研究鮮有報道。采用海藻酸鈣固定化改善脫色效果，交聯劑使用氯化鈣或氯化鋇可提高反應穩定性。 Moutaouakkil等[13]采用不同固定化載體脫色甲基紅染料，其中海藻酸鈣小球脫色效果最佳。因此，本研究利用篩選出的脫色菌，研究其對偶氮染料的生物降解作用，并采用氯化鐵作為新型交聯劑，制備磁性固定化小球，提高抵抗環境因素的能力，以期豐富微生物固定化研究報道。

1 試 驗

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

菌株篩選自上海市松江區污水處理廠二沉池中的活性污泥。

1.1.2 試劑

顏料紅23購買于某化工廠，呈暗藍光紅色，耐光牢度僅為3級。顏料紅23的粒徑小，呈透明型，黏度較高，耐溶劑性能較差，在包裝印墨中出現結晶現象。其可用于織物印花，NC-型及水性印墨，亦可用于涂料著色，但耐罩漆性能稍差。外觀呈紅色粉末，分子式為C24H17N5O7，相對分子質量為487，密度為1.47 g/cm3，熔點為330～340 ℃，折射率為1.693。海藻酸鈉(SA)、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鐵(FeCl3)、魚粉蛋白胨、酵母粉、瓊脂、七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)等試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

固體培養基：10 g魚粉蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、15 g瓊脂和1 L蒸餾水，pH=6.8～7.2。

富集培養基：10 g魚粉蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl和1 L蒸餾水，pH=6.8～7.2。

脫色培養基：0.1 g CaCl2、0.5 g MgSO4·7H2O、1 g NaCl、1 g KH2PO4、1 g Na2HPO4、10 g酵母粉、100 mg顏料紅23和1 L蒸餾水，pH=6.8～ 7.2。

1.1.4 主要儀器

BSA124S型電子分析天平、UV-1800PC型紫外可見分光光度計、BXM-30R2型立式壓力蒸汽滅菌器、R56-300型光照培養箱、VS-840-1型潔凈工作臺、HANNAm8424型pH/ORP測定儀、CT14RD型臺式高速冷凍離心機、SK250H型超聲波清洗器、SPH-2102C型立式雙層搖床、Sirion 200型高分辨場發射掃描電子顯微鏡和比表面積和孔徑分析儀。

1.2 菌株鑒定

采用環境微生物試驗方法對菌體進行革蘭氏染色，之后進行掃描電子顯微鏡分析。委托上海基康生物技術有限公司對菌株基因組DNA進行提取及16S rDNA測序，并與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的數據庫進行同源性比較，構建系統發育樹。

1.3 菌懸液制備

在無菌條件下，將菌株接種到裝有100 mL富集培養基的250 mL滅菌錐形瓶中，在35 ℃和120 r/ min環境下恒溫培養48 h。取出10 mL富集培養的菌液置于滅菌離心管中，以6 000 r/min的轉速離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌并離心2次，配成一定體積百分濃度的菌懸液。

1.4 菌體生長曲線及染料降解曲線測定

在無菌條件下，將100 mL脫色培養基分裝入250 mL滅菌錐形瓶中。在顏料紅23的脫色培養基中接種10%的菌懸液，放入35 ℃和120 r/min環境下恒溫培養一定時間。每2 h取樣，測量菌體細胞密度(OD600)及上清液在579 nm處吸光度。以無菌的脫色培養基做空白對照，計算脫色率。重復3次取平均值，得到菌株生長曲線及染料降解曲線。

1.5 固定化菌球的制備

取一定量SA置于50 mL無菌水中，在加熱條件下完全溶解后配成膠狀溶液，冷卻至30 ℃。在無菌條件下，將適量菌懸液與膠狀溶液混合均勻，采用1 mL注射器將其快速地滴入不斷攪拌的交聯劑中，將形成的均勻規則的小球置于4 ℃冰箱內靜置24 h。 將固化交聯后的小球用蒸餾水清洗2次，即得固定化菌球。

1.6 固定化菌球對染料脫色因素的研究

選取交聯劑種類、交聯劑濃度、接種量和投加量作為影響因素，制備固定化小球，將其添加至100 mL顏料紅23的脫色培養基中，在35 ℃和120 r/min環境下恒溫培養一定時間后測定脫色率。研究單一因素的最佳條件，判斷各因素對顏料脫色效果的影響。每個因子均設置不同的影響梯度，研究其中某一因素的影響時，僅對該因素設置不同梯度，其他因素保持不變，后續因素試驗以前面試驗得到的各因素最適條件為前提進行。重復3次取平均值。

1.7 脫色率計算

取10 mL脫色后溶液，以10 000 r/min的轉速離心6 min，按式(1)計算其脫色率。

(1)

式中：w為脫色率(%)；A0為無菌脫色培養基在579 nm 的吸光度；At為脫色后上清液在579 nm的吸光度。

2 結果與討論

2.1 菌株的革蘭氏染色及電鏡掃描

該菌株經多次平板劃線分離培養后，放入35 ℃恒溫環境中培養48 h，在固體培養基上生長的菌落如圖1(a)所示，其形態為圓形、邊緣整齊、呈黃色、不透明、隆起且有黏性。對菌株進行革蘭氏染色，電鏡掃描結果如圖1(b)所示，經革蘭氏染色后呈紅色為革蘭氏陰性菌。電鏡掃描呈現出該菌株的微觀結構如圖2所示，菌體呈兩截短桿狀，無鞭毛。

(a) 固體培養基上的菌落(b) 革蘭氏染色圖1 活化后的菌株Fig.1 Picture of the strain and gram staining

圖2 菌株的掃描電鏡Fig.2 SEM micrograph of the strain

2.2 菌株的16S rDNA序列分析

經16S rDNA基因測序鑒定，該菌株構建的系統發育樹如圖3所示，通過相似度99%可判斷該菌株為微嗜酸寡養單胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphilasp.)。

圖3 菌株的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of the strain

2.3 菌株生長曲線及染料脫色曲線

菌株生長及其對顏料紅23脫色曲線如圖4所示。由圖4可知，微嗜酸寡養單胞菌的適應期較短，在2 h后進入對數期，2～18 h內生長繁殖快，代謝活力強，隨后進入平穩期，該趨勢與蘇萌等[14]研究的偶氮染料脫色菌Lysinibacillussp.生長趨勢相類似。18 h后菌株對顏料紅23的脫色效率達90%以上，表現出高效脫色能力。對脫色代謝產物在200～900 nm范圍內進行紫外可見分光光度計掃描發現，該菌株對顏料紅23的脫色方式以生物降解為主。

圖4 微嗜酸寡養單胞菌的生長曲線及對顏料紅23的脫色曲線Fig.4 Growth rate of the strain and decolorization rate on pigment red 23

2.4 固定化小球的制備及脫色性能研究

2.4.1 固定化小球的制備

海藻酸鈉(SA)為應用較為廣泛的微生物固定化載體。采用SA作為固定化包埋材料，在不同質量分數下制備固定化小球，其性狀如圖5所示。由圖5可知：當SA質量分數為1.5%和2.0%時，成球的形狀規則、硬度和彈性均呈現較好的性狀；SA質量分數低于1.0%時，成球性能較差，彈性和硬度較低；當SA質量分數過高時，小球有嚴重的拖尾現象，交聯程度過高，導致彈性和載體通透性降低從而影響降解效率。考慮成本因素，采用質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體制備小球。

圖5 不同SA質量分數制備的固定化小球性狀比較Fig.5 Properties of immobilized pellets prepared with different mass fraction of SA

2.4.2 交聯劑種類對脫色性能的影響

將質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體，添加體積分數為2%的菌懸液，將其滴加至質量分數為5%的CaCl2、BaCl2、FeCl3、NiCl2、CoCl2、FeCl2、ZnCl2等溶液中制備固定化小球，試驗結果顯示SA與多種金屬離子均可進行交聯。在制備固定化小球時，不同交聯劑對菌株細胞的親和力不同，最終會影響小球性狀。試驗中觀察到FeCl3作為交聯劑時小球比表面積最大，FeCl2、NiCl2和CoCl2作為交聯劑時成球性較差。交聯劑的種類對菌株脫色率的影響如表1所示。由表1可知，采用交聯劑CaCl2、BaCl2、FeCl3和FeCl2制備的固定化小球對顏料紅23均表現出較好的脫色效果，其中以FeCl3最為顯著，提高了菌株與包埋材料的親和力，增強了對顏料紅23的脫色能力，這與秦勝東等[15]關于菌株對不同無機材料的附著能力研究結果相一致。因此，后續試驗選用FeCl3作為制備固定化菌球的交聯劑。

表1 交聯劑種類對菌株脫色率的影響Table 1 Effect of cross-linking agents on decolorizationrate of pigment red 23

2.4.3 交聯劑質量分數對脫色性能的影響

將質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體，添加體積分數為2%的菌懸液，滴加至質量分數為3%、 4%、 5%、 6%和7%的FeCl3溶液中。交聯劑濃度對菌株脫色率的影響如表2所示。由表2可知，不同質量分數的FeCl3溶液制備的固定化菌球對顏料紅23均具有一定的脫色效果，且隨著FeCl3質量分數的增大，脫色效果逐漸加強，當FeCl3質量分數為5%時脫色效果最佳。當交聯劑質量分數過高時，由于固定化載體中Na+含量限定了可交聯的Fe3+數量，交聯作用達到飽和，菌株對顏料紅23的脫色基本保持不變。因此，后續試驗選取交聯劑FeCl3的質量分數為5%。

表2 FeCl3質量分數對菌株脫色率的影響Table 2 Effect of FeCl3 mass fraction on thedecolorization rate of pigment red 23

表3 菌株接種量對菌株脫色率的影響Table 3 Effect of the strain’s inoculation concentration ondecolorization rate of pigment red 23

2.4.4 菌株接種量對脫色性能的影響

將質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體，質量分數為5%的FeCl3溶液作為交聯劑，接種體積分數為0、 1%、 2%、 4%、 6%和8%的菌懸液，制備固定化菌球。菌株接種量對菌株脫色率的影響如表3所示。由表3可知：菌懸液體積分數為4%時，脫色率達到81%，此時脫色率主要取決于固定化小球表面吸附的菌株量；菌懸液體積分數由4%增至8%時，由于包埋菌體過多，生存空間狹小，營養源和溶解氧有限，產生競爭，抑制菌體生長，脫色率逐漸降低，該趨勢與包木太等[16]研究包埋種子菌濃度對微球性能的影響時得出的結論相似。因此，制備固定化菌球的最優菌懸液體積分數為4%。

2.4.5 固定化小球投加量對脫色性能的影響

將質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體，質量分數為5%的FeCl3溶液作為交聯劑，接種體積分數為4%的菌懸液制成固定化小球，在100 mL顏料紅23脫色培養基中設置固定化小球投加量梯度為1、 3、 4、 5、 6、 7和9 g。固定化小球的投加量對脫色率的影響如表4所示。由表4可知，投加量為5 g時，菌株對顏料紅23的脫色率達到89%。投加量過低時，由于菌體含量較低，導致脫色作用有限；投加量過高時，菌體由于生長空間和營養源有限，生長受到抑制而活性降低甚至死亡，對顏料紅23的脫色率降低。當被包埋的菌株保持良好的活躍狀態時，脫色率隨菌體含量增加而增大。因此，固定化小球的最佳投加量為5 g。

表4 固定化小球的投加量對菌株脫色率的影響Table 4 Effect of immobilized pellet quality on decolorizationrate of pigment red 23

2.5 固定化菌球的性狀表征

2.5.1 掃描電子顯微鏡分析

將質量分數為1.5%的SA溶液作為固定化載體，質量分數為5%的FeCl3溶液作為交聯劑，接種體積分數為4%的菌懸液制成固定化菌球，將其用于顏料紅23的脫色。降解前后固定化菌球的掃描電子顯微鏡圖和小球的直觀圖如圖6所示。由圖6可知，固定后的微生物小球呈黃色，形狀規則，大小均一，顆粒直徑約為5 mm。圖6(a)為無菌的固定化小球，從高倍鏡下小球形貌看出，固定后小球褶皺均勻規整；圖6(b)和(c)為低、高倍鏡下的固定化菌球，從形貌可以看出，接種菌液后的小球表面凹凸不平，覆蓋有胞狀物質，且分布不均勻，可能是由于接種后菌株被包埋或者吸附在小球的孔隙中生長，形成了單菌；圖6(d)表明降解后的小球表面孔徑明顯增大，推測其內部物質可能與顏料紅23脫色培養基進行反應。

圖6 降解前后固定化菌球的掃描電子顯微鏡圖和小球的直觀圖Fig.6 SEM micrographs of the immobilized pellet before/after degradation and macroscopic photo of the pellet

2.5.2 比表面積分析

降解前后的固定化菌球比表面積測定結果如表5所示。由表5可知，降解后的固定化菌球比表面積有所減小，孔徑略微增大，這表明高倍鏡下觀察到的覆蓋在小球表面的物質很可能為微嗜酸寡養單胞菌體。小球的比表面積較大，投加后與脫色培養基進行反應，附著在小球表面的菌株減少，并且通過孔徑的傳質作用，包埋在小球內部的菌株和Fe3+可增強對顏料紅23的脫色作用。

表5 降解前后固定化菌球的比表面積及孔徑Table 5 The surface area and pore diameter of the immobilized pellet before/after degradation

2.5.3 能譜分析

圖7 固定化菌球表面元素分布Fig.7 Elemental distribution on the surface of the immobilized pellet

投加前菌球表面元素分布如圖7所示。由圖7可知：C、Na、Cl、Fe等主要元素分散良好，小球成球性狀較好，分布密度均勻；O元素的分布密度不均，高密度區域與高倍鏡下的掃描電鏡圖表征結果一致。由此表明，覆蓋在小球表面的物質為微嗜酸寡養單胞菌體，通過固定化作用將菌株隨機限定在載體上，可保持良好的分散狀態[17]。

降解前后固定化菌球的能譜分析如圖8所示。對比可知，降解后小球出現N和P元素特征峰，C和O等元素特征峰加強、含量增多，其中O元素特征峰明顯升高，說明固定后的菌株保持活性，在外加營養源的作用下生長。降解后小球的Fe和Cl等元素含量相對減少，Na元素含量增多，這表明小球投加后與脫色培養基進行反應，通過孔徑進行傳質作用，染料可以擴散到小球內部，有利于對顏料紅23進行脫色。

(a) 降解前

(b) 降解后圖8 降解前后固定化菌球能譜分析

Fig.8EDSanalysisoftheimmobilizedpelletbefore/afterdegradation

3 結 論

(1) 本文分離培養的微嗜酸寡養單胞菌為高效脫色菌株，在35 ℃和120 r/min環境下培養18 h后對顏料紅23的脫色率達90%以上。經紫外可見分光光度計掃描脫色代謝產物可知，該菌株對顏料紅23的生物脫色方式以生物降解為主。

(2) 以質量分數為1.5%的SA溶液為固定化載體，質量分數為5%的FeCl3溶液為交聯劑，接種體積分數4%的菌懸液制成固定化菌球，菌體在小球表面穩定分散，具有較高的微生物活性。

(3) 菌球投加后，比表面積減小，孔徑增大，18 h后對顏料紅23的脫色率在89%左右。脫色過程中無惡臭產生，分離回收簡單，對微生物固定化技術處理印染廢水有一定的現實意義。